高濃度棕櫚酸對MIN6細(xì)胞胰高糖素樣多肽1受體(GLP-1R)表達(dá)的影響及作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　 現(xiàn)時糖尿病已經(jīng)發(fā)展成為全球高度關(guān)注的疾病，患病增長率極高。近幾十年來，隨著人們生活水平的不斷提高，高脂飲食的攝入過多，肥胖患者不斷增加，血脂代謝異常對糖尿病的危害以及防治也受到越來越多的重視。來自于腸的信號可增強(qiáng)胰島對營養(yǎng)物質(zhì)的應(yīng)答反應(yīng)，這個作用被稱為“腸促胰島素反應(yīng)”。胰高血糖素樣肽1（Glucagon like peptide-1，GLP-1）是腸-胰島軸中最為重要的激素介質(zhì)，主要通過與其特異性受體相結(jié)合而發(fā)揮

2、作用。因此，GLP-1受體(GLP-1R)的存在與功能的正常對于GLP-1的功能發(fā)揮有著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者對外源性GLP-1刺激的反應(yīng)比較遲鈍，且胰島細(xì)胞GLP-1R表達(dá)減少。肥胖或血游離脂肪酸的升高同樣也可導(dǎo)致患者腸-胰軸功能受損，參與糖尿病病程的進(jìn)展，但是對于其機(jī)制仍不是很清楚。本研究通過體外建立脂毒性胰島β細(xì)胞模型，進(jìn)一步通過細(xì)胞水平探討其與腸-胰島軸的相關(guān)性及作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1

3、.倒置相差顯微鏡觀察0.5mM棕櫚酸(Palmitate，PA)作用MIN6細(xì)胞48小時后細(xì)胞形態(tài)變化;
　　 2.利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測在0、0.1、0.3、0.5mmol/L PA濃度干預(yù)MIN6細(xì)胞12h、24h、48h后細(xì)胞活性的變化;并利用WB技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白CHOP、caspase3的表達(dá);
　　 3.采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及Western blot(WB)檢測不同濃度棕櫚酸干預(yù)后MIN6細(xì)胞后GLP-1R

4、蛋白的表達(dá)情況;并利用熒光定量PCR檢測MIN6細(xì)胞GLP-1R mRNA水平變化;WB檢測PKB、PKCα蛋白及磷酸化水平變化;
　　 4.分別予高糖或高糖+GLP-1刺激MIN6細(xì)胞，ELISA法檢測MIN6細(xì)胞培養(yǎng)液上清胰島素含量的變化;
　　 5.利用含DN-PKB及CA-PKB的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PI3K抑制劑LY294002，PKC激活物TPA與PKCα特異性抑制劑safingol分別干預(yù)MIN6細(xì)胞，Weste

5、m blot檢測PKB、PKCα及其磷酸化蛋白表達(dá)情況，并利用熒光定量PCR及WB技術(shù)檢測GLP-1R表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.正常對照組（BSA組）MIN6細(xì)胞堆聚生長，細(xì)胞間及貼壁均較牢;0.5mM PA作用于細(xì)胞48小時，細(xì)胞體積變小、變形，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
　　 2.PA干預(yù)12小時，細(xì)胞活性無明顯改變;高濃度PA干預(yù)24小時后細(xì)胞活性已有下調(diào);繼續(xù)干預(yù)48h后，發(fā)現(xiàn)隨PA濃度增大

6、細(xì)胞活性明顯下降，并且呈現(xiàn)出一定的量效相關(guān)性。
　　 3.與正常對照組比較，MIN6細(xì)胞PA干預(yù)后，GLP-1R mRNA及蛋白水平均顯著下調(diào)，并與棕櫚酸濃度及作用時間呈濃度依賴性和時間依賴性。
　　 4.與正常對照組比較，MIN6細(xì)胞予0.5mM PA處理48h后，PKCα(ser657)磷酸化增強(qiáng)，PKB(ser473)磷酸化減弱。
　　 5.與正常對照組比較，MIN6細(xì)胞予0.5mM PA處理48h后，葡萄

7、糖刺激胰島素釋放作用減弱，同時GLP-1刺激MIN6細(xì)胞釋放胰島素作用受損。
　　 6.TPA干預(yù)4小時后，PKCα活性明顯增強(qiáng)，GLP-1RmRNA水平表達(dá)下調(diào)。加入SAF后細(xì)胞PKCα磷酸化水平減弱，而GLP-1R表達(dá)無明顯變化;與正常對照組比較，含DN-PKB的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MIN6細(xì)胞后，Akt活性減弱，而GLP-1R表達(dá)減少，而含CA-PKB的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MIN6細(xì)胞后，Akt活性增強(qiáng)，GLP-1 R表達(dá)上調(diào);
　　 結(jié)

8、論:
　　 1.長時間的高濃度棕櫚酸作用于MIN6細(xì)胞可引起細(xì)胞變形，凋亡增多，并導(dǎo)致胰島功能受損;
　　 2.高濃度棕櫚酸長時間作用后可導(dǎo)致MIN6細(xì)胞GLP-1R表達(dá)明顯下調(diào)，p-PKB(ser473)水平下調(diào)及p-PKCα(ser657)上調(diào)，GLP-1促進(jìn)MIN6細(xì)胞釋放胰島素作用減弱。
　　 3.棕櫚酸導(dǎo)致MIN6細(xì)胞GLP-1R下調(diào)與PKB信號通路抑制有關(guān)，PKCα信號通路可能并不直接參與GLP-1R