卵巢漿液性癌的起源及診斷研究.pdf

1、卵巢上皮性癌作為女性生殖系統(tǒng)中致死率最高的疾病，其臨床診治意義重大，一直廣受關(guān)注。但是，由于卵巢上皮性癌的起源和發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，長(zhǎng)期以來(lái)一直存在爭(zhēng)議，導(dǎo)致針對(duì)其早期診斷和防治預(yù)后的研究也無(wú)實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。卵巢上皮性癌一度被認(rèn)為是單一疾病，但越來(lái)越多的研究證實(shí)卵巢癌上皮性癌是由一系列臨床病理學(xué)特征和生物學(xué)行為各異的腫瘤組成。目前存在數(shù)種卵巢癌起源和發(fā)病機(jī)制的假說(shuō)，傳統(tǒng)的卵巢表面上皮起源理論一直以來(lái)占據(jù)主要地位。該理論認(rèn)為卵巢上皮性癌起源于卵

2、巢表面生發(fā)上皮，然后由生發(fā)上皮內(nèi)陷形成皮質(zhì)包涵體囊腫，進(jìn)而化生為不同組織學(xué)類型的腫瘤。然而，隨著最近十幾年來(lái)病理形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)以及基因遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，人們對(duì)卵巢表面上皮起源學(xué)說(shuō)有了新的認(rèn)識(shí)并且提供了質(zhì)疑的證據(jù)。從組培發(fā)育的角度來(lái)看，卵巢本身發(fā)生于泌尿生殖嵴的中胚層，卵巢表面上皮來(lái)源于腹膜間皮，表現(xiàn)為單層扁平細(xì)胞的形態(tài)，但卵巢上皮性癌卻表現(xiàn)出諸多表型，包括漿液性、內(nèi)膜樣、粘液性、透明細(xì)胞性、移形細(xì)胞性等。卵巢上皮起源理論認(rèn)為卵巢表面

3、上皮內(nèi)陷生成的皮質(zhì)包涵體（可能在激素作用下）可以化生為不同的組織學(xué)表型。然而研究者卻沒(méi)有找到卵巢表面上皮化生的直接證據(jù)。還有重要的一點(diǎn)為，卵巢上皮性癌的癌前病變一直未在卵巢組織內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。另外，卵巢上皮性癌和卵巢表面上皮在免疫表型上也有所不同。研究發(fā)現(xiàn)間皮素(calretinin)可在卵巢表面上皮表達(dá)，而在卵巢癌中卻完全不表達(dá)。反之，一些生物學(xué)印跡如HOXA、PAX8、PAX2在大多數(shù)卵巢癌中表達(dá)，但在卵巢表面上皮中不表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)雖然不

4、能直接否定卵巢表面上皮起源學(xué)說(shuō)，但卻揭示了假說(shuō)本身存在的缺陷，使得研究者將卵巢癌的起源部位從卵巢本身轉(zhuǎn)移到卵巢之外的盆腔器官。大部分卵巢上皮性癌的組織學(xué)類型表現(xiàn)為高級(jí)別漿液性癌，約占卵巢上皮性癌的75％，因此針對(duì)卵巢漿液性癌的研究不但有學(xué)術(shù)意義，也很有臨床價(jià)值。近年來(lái)，卵巢漿液性癌的輸卵管起源學(xué)說(shuō)獲得了很大的進(jìn)展。研究者在BRCA+婦女的預(yù)防性附件切除標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)輸卵管內(nèi)有高級(jí)別漿液性癌以及原位癌，但在卵巢中卻沒(méi)有找到癌灶和癌前病變。應(yīng)

5、用SEE-FIM發(fā)現(xiàn)散發(fā)性卵巢漿液性癌中70％有輸卵管癌，其中48％是輸卵管上皮內(nèi)癌(TIC)，并且93％發(fā)生于輸卵管傘端。另外，TIC也表現(xiàn)出和卵巢高級(jí)別漿液性癌一致的特征性TP53突變?？傮w來(lái)說(shuō)，目前針對(duì)卵巢漿液性癌輸卵管起源的形態(tài)學(xué)證據(jù)較多，但基因?qū)W證據(jù)尚待完善，可作為研究方向。從基因表達(dá)譜角度探索卵巢漿液性癌和輸卵管之間的同源性并篩選出可行有效的差異基因，對(duì)深入研究和分析卵巢癌的發(fā)病機(jī)制將很有意義。
　　 研究卵巢癌起源

6、的最終目的是為了應(yīng)用于臨床診斷、預(yù)后和防治。卵巢上皮性癌中，高級(jí)別漿液性癌在臨床最為常見(jiàn)，發(fā)病率約占75％。只有約0.5％-1.25％的高級(jí)別漿液性癌局限于卵巢，大部分發(fā)病時(shí)已為晚期，侵襲性強(qiáng)，進(jìn)展迅速，預(yù)后很差，伴隨盆腹腔轉(zhuǎn)移。根據(jù)FIGO指南，盆腹腔沖洗液的診斷影響卵巢癌的手術(shù)病理分期。并且據(jù)研究報(bào)道，盆腹腔沖洗液中查見(jiàn)惡性細(xì)胞，是患者不良預(yù)后的一個(gè)相關(guān)因素。目前臨床診斷盆腔沖洗液主要依據(jù)細(xì)胞學(xué)。然而，細(xì)胞學(xué)診斷存在一定的誤差，亦缺

7、乏特異有效的腫瘤標(biāo)志物，在準(zhǔn)確率方面有待提高。誤差的主要原因?yàn)槁殉矟{液性癌細(xì)胞和反應(yīng)性間皮細(xì)胞在形態(tài)上存在一定相似性，容易混淆。WT1曾被認(rèn)為是診斷卵巢漿液性癌的有效標(biāo)志物，但后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)間皮細(xì)胞也可表達(dá)WT1。因此，尋找敏感性和特異性好的標(biāo)志物，對(duì)于準(zhǔn)確診斷盆腔沖洗液中有無(wú)惡性卵巢癌細(xì)胞意義重大。起源研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌和輸卵管在免疫表型和生物學(xué)印記方面存在相似性，其中包括PAX8蛋白的表達(dá)。PAX8作為PAX家族的成員之一，在人體組織器官

8、發(fā)生發(fā)育中起重要作用。PAX8在卵巢癌組織中有特異性表達(dá)，但在間皮組織中不表達(dá)。因此，通過(guò)對(duì)PAX8表達(dá)的檢測(cè)來(lái)識(shí)別盆腔沖洗液（尤其是細(xì)胞學(xué)可疑病例）中的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞，將具有一定可行性。另外，眾所周知，TP53突變是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的常見(jiàn)事件，約80％的高級(jí)別卵巢上皮性癌可表現(xiàn)出p53蛋白的過(guò)表達(dá)。將PAX8和p53聯(lián)合檢測(cè)，將更加有利于提高臨床診斷的準(zhǔn)確率。
　　 基于此，本課題的研究?jī)?nèi)容分為兩部分:
　　 第一部分卵巢

9、漿液性癌起源的基因表達(dá)譜研究
　　 背景和目的
　　 卵巢癌在婦女生殖道疾病中致死率居于首位，其起源和發(fā)病機(jī)制對(duì)臨床診治意義重大。卵巢漿液性癌的輸卵管起源模型目前獲得了很多形態(tài)學(xué)方面的證據(jù)，然而在基因?qū)W方面有待進(jìn)展。在本研究中，我們從基因表達(dá)譜角度探討卵巢漿液性癌和輸卵管之間的同源性并篩選出差異表達(dá)的候選基因，以供下一步分子機(jī)制的深入研究。
　　 材料和方法
　　 1.臨床收集新鮮組織:輸卵管上皮，卵巢上

10、皮，卵巢漿液性癌;
　　 2.提取RNA，行基因光纖微珠芯片分析;
　　 3.比較分析卵巢漿液性癌、輸卵管上皮、卵巢上皮之間的同源性;
　　 4.篩選出候選基因，并行RealtimePCR驗(yàn)證其在三種細(xì)胞中的差異性表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1.通過(guò)聚類分析ClustalX得出:相對(duì)于卵巢上皮，卵巢漿液性癌和輸卵管上皮具有基因譜的相似性;
　　 2.采用SAM、GO分析處理卵巢漿液性癌和輸卵

11、管上皮之間的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)，篩選出6個(gè)候選基因。包括上調(diào)基因S100P、RASIP1、TACSTD2、PTGES,以及下調(diào)基因DKK3、LDOC1;
　　 3.RealtimeRCR證實(shí)S100P、RASIP1、TACSTD2、PTGES、DKK3、LDOC1在卵巢漿液性癌和輸卵管上皮中的基因表達(dá)不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.相對(duì)于卵巢上皮，卵巢漿液性癌和輸卵管上皮具有基因譜相

12、似性，提示了其同源的可能性;
　　 2.候選基因S100P、RASIP1、TACSTD2、PTGES、DKK3、LDOC1可能與卵巢漿液性癌的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，有可能成為其診斷、預(yù)后以及防治的標(biāo)志物需進(jìn)一步探討。
　　 第二部分卵巢癌盆腔沖洗液的細(xì)胞化學(xué)研究
　　 背景和目的
　　 絕大部分卵巢癌患者缺乏早期癥狀，進(jìn)展迅速，就診時(shí)常為晚期，并伴有盆腔的廣泛轉(zhuǎn)移。然而，目前臨床盆腔沖洗液細(xì)胞學(xué)診斷的準(zhǔn)確率有待提

13、高，亦缺乏特異有效的分子標(biāo)志物。研究報(bào)道PAX8在多種腫瘤中有特異性表達(dá)，但不在間皮組織中表達(dá)。另外，TP53突變?yōu)槟[瘤發(fā)生的常見(jiàn)事件，80％的高級(jí)別卵巢漿液性癌可表現(xiàn)出p53蛋白的過(guò)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^(guò)細(xì)胞蠟塊的免疫組化研究，檢測(cè)PAX8和p53在盆腔沖洗液（尤其是細(xì)胞學(xué)可疑病例）中的表達(dá)，評(píng)估其在識(shí)別癌細(xì)胞方面的臨床價(jià)值。
　　 材料和方法
　　 收集92例盆腔沖洗液的細(xì)胞蠟塊，均有完整的臨床以及病理資料。按照細(xì)

14、胞學(xué)診斷分為三組:細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性組、細(xì)胞學(xué)可疑組和細(xì)胞學(xué)陰性組。細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性組共32例（年齡29-83歲，中位數(shù)48.6歲），經(jīng)細(xì)胞學(xué)診斷確認(rèn)為轉(zhuǎn)移性癌。細(xì)胞學(xué)可疑組共29例（年齡17-79歲，中位數(shù)41.5歲），細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)為可疑惡性，形態(tài)學(xué)上類似于反應(yīng)性或不典型性間皮細(xì)胞。細(xì)胞學(xué)陰性組共32例（年齡23-80歲，中位數(shù)44.7歲），細(xì)胞學(xué)診斷為良性或正常細(xì)胞。所有盆腔沖洗液細(xì)胞蠟塊按照5微米厚度切片，進(jìn)行HE染色和免疫組化。
　　

15、結(jié)果
　　 1.PAX8蛋白在三組盆腔沖洗液細(xì)胞蠟塊中的陽(yáng)性表達(dá)率不同。其中，細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性組表達(dá)率為75％(24/32)，細(xì)胞學(xué)可疑組表達(dá)率為6.9％(2/29)，細(xì)胞學(xué)陰性組不表達(dá)。PAX8檢測(cè)方法的靈敏性為75％，特異性100％，在不同組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 2.p53蛋白在三組盆腔沖洗液細(xì)胞蠟塊中的陽(yáng)性表達(dá)率不同。其中，細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性組表達(dá)率為37.5％(12/32)，細(xì)胞學(xué)可疑組表達(dá)率為3.4％(

16、1/29)，細(xì)胞學(xué)陰性組不表達(dá)。p53檢測(cè)方法的靈敏性為37.5％，特異性100％，在不同組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 3.通過(guò)PAX8和p53蛋白的聯(lián)合檢測(cè)，三組盆腔沖洗液細(xì)胞蠟塊表現(xiàn)出不同的陽(yáng)性表達(dá)率。其中，細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性組表達(dá)率為37.5％(12/32)，細(xì)胞學(xué)可疑組表達(dá)率為3.4％(1/29)，細(xì)胞學(xué)陰性組不表達(dá)。p53檢測(cè)方法的敏感性為37.5％，特異性100％，在不同組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。

17、
　　 4.通過(guò)PAX8和p53蛋白的檢測(cè)，各組細(xì)胞蠟塊表現(xiàn)出不同的免疫學(xué)表型。細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性組表現(xiàn)出三種免疫學(xué)表型，分別為:PAX8陽(yáng)性/p53陽(yáng)性，PAX8陽(yáng)性/p53陰性，PAX8陰性/p53陰性。同樣，細(xì)胞學(xué)可疑組也出現(xiàn)了三種免疫學(xué)表型:PAX8陽(yáng)性/p53陽(yáng)性，PAX8陽(yáng)性/p53陰性，PAX8陰性/p53陰性。細(xì)胞學(xué)陰性組只有一種免疫學(xué)表型:PAX8陰性/p53陰性。
　　 5.不同組織學(xué)類型的盆腔沖洗液細(xì)胞蠟塊

18、中PAX8和p53的表達(dá)率不同。根據(jù)形態(tài)學(xué)和免疫組化驗(yàn)證，細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性組包括12例卵巢漿液性癌、7例卵巢子宮內(nèi)膜樣癌、4例子宮內(nèi)膜漿液性癌以及9例子宮內(nèi)膜樣癌。細(xì)胞學(xué)可疑組包括1例卵巢漿液性癌、1例子宮內(nèi)膜樣癌以及27例反應(yīng)性間皮細(xì)胞。細(xì)胞學(xué)陰性組31例細(xì)胞蠟塊均為良性間皮細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)來(lái)說(shuō)，PAX8在卵巢漿液性癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為92.3％(12/13)，在卵巢內(nèi)膜樣癌中的陽(yáng)性率為71.4％(5/7)，在子宮內(nèi)膜漿液性癌中的表達(dá)率為75％(3

19、/4)，在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達(dá)率為60％(6/10)。p53在卵巢漿液性癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為69.2％(9/13)，在卵巢內(nèi)膜樣癌中的陽(yáng)性率為0％(0/7)，在子宮內(nèi)膜漿液性癌中的表達(dá)率為75％(3/4)，在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達(dá)率為10％(1/10)。針對(duì)PAX8和p53的聯(lián)合檢測(cè)，在卵巢漿液性癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為69.2％(9/13)，在卵巢內(nèi)膜樣癌中的陽(yáng)性率為0％(0/7)，在子宮內(nèi)膜漿液性癌中的表達(dá)率為75％(3/4)，在子宮內(nèi)膜樣癌

20、中的表達(dá)率為10％(1/10)。
　　 6.免疫組化數(shù)據(jù)顯示PAX8和p53表達(dá)的不一致性。PAX8檢測(cè)方法的靈敏性為75％，特異性100％;而p53檢測(cè)方法的靈敏性為37.5％，特異性100％。PAX8和p53聯(lián)合檢測(cè)方法的靈敏性為37.5％，特異性100％。PAX8的表達(dá)比p53要更靈敏，在同一盆腔沖洗液標(biāo)本中，可出現(xiàn)PAX8陽(yáng)性/p53陰性表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 對(duì)PAX8和p53表達(dá)的檢測(cè)，有利于識(shí)別盆

21、腔沖洗液中的癌細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞學(xué)可疑病例可能有輔助鑒別價(jià)值。
　　 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
　　 1.本論文發(fā)現(xiàn)漿液性癌和輸卵管上皮之間存在基因表達(dá)譜的相似性，提示基因同源性;
　　 2.本論文篩選出6個(gè)候選基因S100P、RASIP1、TACSTD2、PTGES、DKK3、LDOC1，可能與卵巢漿液性癌的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，以期成為卵巢癌診斷、預(yù)后以及防治的分子標(biāo)志物;
　　 3.本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)PAX8和p53表達(dá)的檢測(cè)，有利