S-腺苷甲硫氨酸搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化及其初步分離純化研究.pdf

1、S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-methionine，SAM)是一種來源于生物體的天然物質(zhì)，它既可作為疾病治療藥物，又可作為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑的物質(zhì)，可用于治療肝病、肝硬化所致的膽汁郁積、抑郁癥，對各種關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷療效顯著，也是抗衰老的高級保健藥物。本論文利用巴斯德畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)SAM，對其搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上利用離子交換樹脂對SAM的下游工藝的分離純化做了初步研究。
　　 利用HPLC-UV

2、法測定發(fā)酵液中S-腺苷甲硫氨酸。色譜條件為Prevail C18柱，0.06％HFBA溶液-乙腈(80:20)為流動相，用TFA調(diào)節(jié)pH至1.0；柱溫25℃，流速為1.0 mL/min；紫外檢測器的檢測波長為254nm。S-腺苷甲硫氨酸在0.25～1.5g/L范圍內(nèi)，線性回歸比非常顯著(R2=0.9991)。該法簡便、快速、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，適合于S-腺苷甲硫氨酸的定量分析。
　　 通過研究不同發(fā)酵條件對S-腺苷甲硫氨酸發(fā)酵的

3、影響，獲得了最佳搖瓶分批發(fā)酵培養(yǎng)條件：種齡24h；接種量10％；裝液量50 mL/500mL三角瓶；發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH5.8；搖瓶轉(zhuǎn)速為220r/min：發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵周期為72h。利用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了搖瓶分批發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成為(g/L)：甘油60，磷酸(85％)26.7mL，CaSO40.93，K2SO418.0，MgSO414.9，KOH4.13，PTM14mL，28％氨水調(diào)pH；121℃高壓滅菌30min。PTM1(g

4、/L)：CuSO46.0，KI0.08，MnSO43.0，CoCl20.5，ZnCl220.0，F(xiàn)eSO4·7H2O65.0，鉬酸鈉0.2，硼酸0.2，生物素0.2，硫酸5mL；過濾除菌。60g/L甘油濃度的培養(yǎng)基中甲醇的最佳誘導(dǎo)量為0.30％。最佳L-甲硫氨酸加入量為8g/L，采用在發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)后一次性加入的方式為最佳。
　　 對畢赤酵母細(xì)胞采用20％三氯乙酸化學(xué)滲透法破碎提取S-腺苷甲硫氨酸，研究得SAM在pH=2，溫度

5、為10℃時(shí)穩(wěn)定性最好。
　　 通過對不同離子交換樹脂分離SAM的研究，確定了一種分離效果較理想的樹脂--JK006，通過研究此樹脂對S-腺苷甲硫氨酸的靜態(tài)吸附條件，并在離子交換柱上對S-腺苷甲硫氨酸吸附、洗脫條件進(jìn)行了部分研究。確定了離子交換樹脂JK006對S-腺苷甲硫氨酸的靜態(tài)吸附條件為：靜態(tài)吸附時(shí)間為60min，pH范圍為1.0～4.0，考慮到SAM的穩(wěn)定性，確定最佳吸附pH為2.0。通過研究離子交換樹脂的吸附量、pH、上柱