胃癌相關成纖維細胞源生長因子和趨化因子的高通量篩選和驗證.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、胃癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的消化系統(tǒng)腫瘤,在世界范圍內發(fā)病率并不平衡,但病人總體5年死亡率超過80%,每年因胃癌死亡的人數(shù)居世界癌癥死亡病人的第二位,嚴重威脅著人類健康。新近,腫瘤研究中出現(xiàn)了一些新的思路和技術,例如對腫瘤微環(huán)境的再認識以及蛋白質組學的迅猛發(fā)展,將為胃癌發(fā)病機理和防治研究帶來新的契機。腫瘤組織微環(huán)境由功能性上皮、細胞外基質(Extracellularmatrix,ECM)和間質細胞三部分組成,后者主要包括成纖維細胞、各

2、種免疫細胞和血管/淋巴管內皮細胞;此外,腫瘤細胞還可以合成、分泌到細胞外間隙中新的基質成分。目前對腫瘤微環(huán)境的認識主要包括:1.微環(huán)境是細胞基因不穩(wěn)定性的來源,可以誘發(fā)基因突變和DNA損傷,并導致DNA修復通路失調;2.許多有明確致癌作用的理化因素(慢性炎癥、化學致癌物等)是通過破壞微環(huán)境的組織結構、改變間質細胞因子表達譜并重塑細胞外基質,從而刺激功能細胞發(fā)生惡變的;3.腫瘤細胞生長、侵襲、轉移所需的氧、營養(yǎng)成分和生長刺激信號被認為是來

3、自于周圍的間質細胞;4.在適當?shù)奈h(huán)境中,惡性細胞可以被誘導恢復分化狀態(tài)。5.ECM中存在的抗腫瘤成分,例如:腫瘤抑素(tumstatin)、內皮抑素(endostatin),已經得到成功分離正在進行臨床試驗。現(xiàn)有的一些研究已經表明,成纖維細胞在腫瘤微環(huán)境中的研究有著重要意義和良好前景:1.成纖維細胞組織微環(huán)境中主要的間質細胞,也是產生ECM(例如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原與纖維連接蛋白)和組織蛋白酶的主要細胞,處于“基質母細胞”的地位;2.成纖

4、維細胞是正常組織結構的“守護者”,存在抑制周圍上皮細胞發(fā)生惡變的機制,已發(fā)生癌變的細胞在正常成纖維細胞環(huán)境下也可以向正常細胞分化;3.成纖維細胞還是上皮細胞增生、分化的“調控者”,成纖維細胞發(fā)生轉化后可以表達多種細胞因子、粘附分子直接作用于上皮細胞,促進腫瘤細胞的發(fā)生、生長、血管生成、浸潤與轉移。因此,對腫瘤微環(huán)境中成纖維細胞進行深入研究必將有助于對腫瘤發(fā)生機制以及浸潤、轉移等生物學行為的理解以及新的治療靶點的發(fā)現(xiàn)。
   鑒于

5、成纖維細胞具有組織特異性,哺乳動物成纖維細胞具有高度異質性,不同部位分離出來的成纖維細胞反映出明顯的部位多樣性。最近的研究表明,和不同譜系的白細胞的基因表達模式一樣,從16個不同部位分離出來的50個人成纖維細胞種群的基因表達模式也有部位的特異性,存在于不同部位的成纖維細胞分泌不同的胞外基質成分、生長因子和分化因子。那么胃癌發(fā)生過程中是否存在組織特異的分泌因子或信號蛋白?是否還存在未知的、與胃癌發(fā)生密切相關的成纖維細胞生長因子?本項目擬從

6、胃癌相關成纖維細胞切入胃癌微環(huán)境的研究,體外培養(yǎng)和鑒定人胃粘膜成纖維細胞(HGMF)和胃癌相關成纖維細胞(GCAF),接著對從HGMF和GCAF從形態(tài)學、細胞學和生物學功能各方面進行對比,證實二者確實存在顯著的生物學行為方面的差異,進而利用人細胞因子芯片技術對HGMF和GCAF的培養(yǎng)上清液進行分析,篩選出差異因子,選擇其中表達量較高,差異較明顯,且文獻報道與腫瘤密切相關的生長因子以及趨化因子用ELISA法在HGMF-GCAF上清液之間及

7、正常-胃癌血清間進行驗證。這些胃癌成纖維細胞來源的生長因子和趨化因子的表達差異提示胃癌微環(huán)境中的成纖維細胞在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用,進一步探討它們與胃癌類型、分期的關系,可能尋找GCAF表達和分泌的、與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的關鍵蛋白。HGMF和GCAF功能上的差異研究將為下一步對兩者進行蛋白質組學分析,建立HGMF和GCAF各自的蛋白表達譜并篩選出二者之間的差異蛋白提供實驗基礎。此外,對HGMF和GCAF之間的差異蛋白進行深

8、入的研究和分析,可能會發(fā)現(xiàn)新的、與胃癌密切相關的成纖維細胞源因子。
   第一部分胃粘膜成纖維細胞的原代培養(yǎng)、鑒定和培養(yǎng)條件的優(yōu)化
   目的:原代培養(yǎng)和鑒定人胃粘膜成纖維細胞,并對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,提高培養(yǎng)成功率,使其適用于進一步研究需要。
   方法:
   1.人胃粘膜成纖維細胞的原代分離和培養(yǎng)采用植塊法。
   2.人胃粘膜成纖維細胞的鑒定:分別用免疫組化方法和流式細胞術分別檢測角蛋白(k

9、eratin)、波形絲蛋白(vimentin)和結蛋白(Desmin)表達情況。
   3.人胃成纖維細胞的原代培養(yǎng)條件的優(yōu)化;選擇培養(yǎng)表面、培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)液PH值三個因素,每個因素設三個水平,觀察不同組合條件下原代培養(yǎng)成纖維細胞的游出情況。
   結論:
   1.人胃粘膜成纖維細胞的原代從取材、運輸、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件等都有其特殊要求,原代培養(yǎng)的條件優(yōu)化后可行性和可重復性較高。
   2.通過原代培

10、養(yǎng)可以獲得高純度的人胃黏膜成纖維細胞。
   第二部分體外胃癌相關成纖維細胞(GCAF)和人胃粘膜成纖維細胞(HGMF)形態(tài)學、生物學特性和功能差異分析
   目的:探討胃癌相關成纖維細胞(GCAF)和人胃粘膜成纖維細胞(HGMF)在生物學特性和功能活性方面的差異。
   方法:
   1.細胞HE染色光鏡觀察和透射電鏡觀察HGMF和GCAF形態(tài)學上的差異。
   2.CCK-8法檢測兩者的增殖活

11、性并繪制生長曲線。
   3.BCA法檢測兩者的總蛋白。
   4.流式細胞術檢測HGMF和GCAF的細胞周期。
   5.分別用CCK-8法、Tanswell小室檢測及流式細胞檢測GCAF條件培養(yǎng)基對胃癌細胞系BGC-823增殖、侵襲能力和細胞周期的影響。
   結論:原代培養(yǎng)的GCAF和HGMF在形態(tài)學、細胞增殖能力、總蛋白含量、細胞周期及其對胃癌細胞增殖和侵襲的影響等方面存在顯著差異。 第三部分 G

12、CAF和HGMF培養(yǎng)上清液細胞因子芯片檢測及ELISA驗證
   目的:篩選GCAF和HGMF源差異細胞因子并進行驗證。
   方法:
   1.細胞培養(yǎng)上清液制備:取1×106個生長良好的第3代GCAF和HGMF,以純RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后收集細胞培養(yǎng)上清備用。
   2.RayBio(R)人細胞因子抗體芯片檢測GCAF和HGMF上清液中120種因子的表達量,采集圖象和數(shù)據(jù),計算各抗體表達的

13、標準值。
   3.根據(jù)細胞因子芯片篩選結果選擇肝細胞生長因子(HGF)、血管生成素(Angiogenin)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、人細胞間粘附分子-1(sICAM-1)和人胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、RANTES(Regulated upon activation,normalT cell expressed andsecreted)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic pro

14、tein1,MCP-1)、CCL16/HCC-4(Hemofiltrate CC Chemokine4),CXCL9/MIG,人粘膜相關上皮趨化因子(MEC/CCL28)、GROα/CXCL1(growth-related oncogene),用ELISA法在擴大樣本量的HGMF-GCAF上清液之間及正常-胃癌血清間進行驗證。
   結論:GCAF與HGMF在部分細胞因子分泌水平上存在顯著差異,可能是兩者功能活性差異的重要生物學

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