‘無核甌柑’、溫州蜜柑無核的細胞及分子機理研究.pdf

1、柑橘雄性不育是導致柑橘果實無核的主要原因之一。本實驗對細胞質雄性不育柑橘品種‘國慶一號’溫州蜜柑小孢子發(fā)育過程進行了研究，并克隆到幾個可能與胞質雄性不育相關的線粒體基因，應用RT-PCR、Northern雜交和RNA原位雜交技術對這些線粒體基因在花藥發(fā)育過程中的時空表達情況進行研究。此外對‘甌柑’突變品種‘無核甌柑’以及其他一些不育或低育柑橘品種，應用細胞學、組織化學等手段對它們的不育原因進行了初步研究。主要研究結果如下： 1、

2、對普通‘甌柑’及其無核突變體的花粉形態(tài)及育性進行觀察和測定，發(fā)現(xiàn)兩者的花粉粒外觀結構相同，花粉量相近；但普通‘甌柑’成熟花粉的KI-I<,2>和FDA染色活力分別為84.5％和71.4％，而‘無核甌柑’均為0；這說明花粉敗育是導致‘無核甌柑’無核的主要原因。 采用半薄切片對普通‘甌柑’和‘無核甌柑’的小孢子發(fā)育過程進行了對比觀察，發(fā)現(xiàn)‘無核甌柑’幾乎全部的四分體都表現(xiàn)出異常。采用壓片法對‘無核甌柑’的四分體時期進行觀察，發(fā)現(xiàn)存在

3、著從單分體、二分體、三分體、四分體一直到七分體等各種情況的異常現(xiàn)象，而且在每個異常的四分體中，小孢子的大小極不均一，從而導致最后形成的花粉粒也極不一致，其花粉粒的直徑從10μm到30μm不等；而普通‘甌柑’中皆為正常的四分體。這進一步說明減數(shù)分裂異常是導致‘無核甌柑’花粉敗育的主要原因。 組織化學檢測發(fā)現(xiàn)，普通‘甌柑’成熟花粉粒中含有大量淀粉粒，而‘無核甌柑’花粉中很少；普通‘甌柑’成熟花粉粒表面積累的脂類物質也比‘無核甌柑’多

4、；因而推測淀粉、多糖等營養(yǎng)物質積累的不足可能是‘無核甌柑’花粉不能萌發(fā)的主要原因之一。 2、對‘國慶一號’溫州蜜柑花粉育性和果實種子數(shù)進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其花粉醋酸洋紅染色活力為35％，萌發(fā)活力為零，說明其花粉是完全不育的；‘國慶一號’溫州蜜柑自然狀態(tài)下平均每果種子數(shù)為1粒，而當用枳花粉對其進行授粉后發(fā)現(xiàn)，其平均每果種子數(shù)增加到4粒。花粉敗育是導致‘國慶一號’溫州蜜柑無核的主要原因。 采用半薄切片對‘國慶一號’溫州蜜柑小孢子

5、發(fā)育過程進行了觀察并將這一過程劃分為4個時期，即小孢子母細胞形成期、小孢子母細胞減數(shù)分裂期、花粉粒形成期和花粉敗育期；并確定了小孢子的敗育時期最早出現(xiàn)在減數(shù)分裂期，但其大量敗育主要發(fā)生在小孢子從四分體中釋放出來之后的花粉發(fā)育早期。花粉母細胞減數(shù)分裂行為觀察發(fā)現(xiàn)，其減數(shù)分裂行為中期I不正常比例只占16.9％，后期I全部正常，說明其減數(shù)分裂基本正常，進一步證實了‘國慶一號’小孢子的敗育時期主要發(fā)生在減數(shù)分裂之后的花粉發(fā)育早期。而TUNEL檢

6、測發(fā)現(xiàn)，在‘國慶一號’溫州蜜柑花粉敗育時期的花藥絨氈層細胞中檢測到DNA損傷信號；同時在四分體時期的母細胞中也出現(xiàn)DNA損傷，并且在從四分體中釋放出來的小孢子中大量檢測到DNA損傷信號。說明在‘國慶一號’溫州蜜柑的絨氈層和小孢子發(fā)育過程中可能存在著細胞程序性死亡現(xiàn)象。 3、根據(jù)線粒體基因的高度保守區(qū)段序列設計引物，從‘國慶一號’溫州蜜柑中擴增得到三個線粒體基因片段Citatp6，Citcob和CitcoxⅡ，序列比對分析發(fā)現(xiàn)它們

7、與其他10余種植物中的atp6，cob和coxⅡ基因分別具有85％，98％和96％的同源性；Southem雜交發(fā)現(xiàn)它們在柑橘中為多拷貝。 RT-PCR和Northern雜交發(fā)現(xiàn)Citatp6，Citcob和Citcoxll的表達模式相似，都是在‘國慶一號’溫州蜜柑葉片和減數(shù)分裂時期的花蕾中大量表達；Citcob只產(chǎn)生一個轉錄本，而Citatp61和CitcoxⅡ產(chǎn)生兩個轉錄本。RNA原位雜交結果進一步表明Citatp6、Citc

8、ob和CitcoxⅡ表達規(guī)律相似，在花粉母細胞中的表達很低，在花粉母細胞減數(shù)分裂時期表達不斷增強，四分體時期的小孢子母細胞中達到最強，在釋放的小孢子中逐漸減弱，在成熟以及敗育的花粉中不再表達；在絨氈層中的表達也具有特異性，也是在四分體時期達到最高，在小孢子形成時期顯著降低，最后在成熟以及敗育的花粉時期檢測不到表達。推測線粒體基因在‘國慶一號’溫州蜜柑花藥中的特異性表達可能改變了其雄配子發(fā)育過程的線粒體呼吸狀態(tài)，進而導致其雄性不育。

9、 4、采用細胞學、組織化學等方法對四個不同育性柑橘品種‘耐濕臍橙’、‘國慶一號’、‘華農(nóng)本地早’橘和‘HB’柚進行了對比研究。研究發(fā)現(xiàn)‘耐濕臍橙’只形成胞原細胞，隨后開始降解，以致花藥敗育無花粉產(chǎn)生；其他品種小孢子都經(jīng)歷減數(shù)分裂過程形成花粉粒，但不育品種‘國慶一號’在小孢子從四分體中釋放出來后大量敗育；組織化學檢測發(fā)現(xiàn)在可育成熟花粉中含大量淀粉粒，花粉表面積累大量脂類物質，而不育花粉相應積累較少；對不同時期花藥POD同工酶電泳發(fā)現(xiàn)，在