‘無核甌柑’、溫州蜜柑無核的細(xì)胞及分子機(jī)理研究.pdf

1、柑橘雄性不育是導(dǎo)致柑橘果實(shí)無核的主要原因之一。本實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞質(zhì)雄性不育柑橘品種‘國慶一號’溫州蜜柑小孢子發(fā)育過程進(jìn)行了研究，并克隆到幾個可能與胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因，應(yīng)用RT-PCR、Northern雜交和RNA原位雜交技術(shù)對這些線粒體基因在花藥發(fā)育過程中的時空表達(dá)情況進(jìn)行研究。此外對‘甌柑’突變品種‘無核甌柑’以及其他一些不育或低育柑橘品種，應(yīng)用細(xì)胞學(xué)、組織化學(xué)等手段對它們的不育原因進(jìn)行了初步研究。主要研究結(jié)果如下： 1、

2、對普通‘甌柑’及其無核突變體的花粉形態(tài)及育性進(jìn)行觀察和測定，發(fā)現(xiàn)兩者的花粉粒外觀結(jié)構(gòu)相同，花粉量相近；但普通‘甌柑’成熟花粉的KI-I<,2>和FDA染色活力分別為84.5％和71.4％，而‘無核甌柑’均為0；這說明花粉敗育是導(dǎo)致‘無核甌柑’無核的主要原因。 采用半薄切片對普通‘甌柑’和‘無核甌柑’的小孢子發(fā)育過程進(jìn)行了對比觀察，發(fā)現(xiàn)‘無核甌柑’幾乎全部的四分體都表現(xiàn)出異常。采用壓片法對‘無核甌柑’的四分體時期進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)存在

3、著從單分體、二分體、三分體、四分體一直到七分體等各種情況的異常現(xiàn)象，而且在每個異常的四分體中，小孢子的大小極不均一，從而導(dǎo)致最后形成的花粉粒也極不一致，其花粉粒的直徑從10μm到30μm不等；而普通‘甌柑’中皆為正常的四分體。這進(jìn)一步說明減數(shù)分裂異常是導(dǎo)致‘無核甌柑’花粉敗育的主要原因。 組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，普通‘甌柑’成熟花粉粒中含有大量淀粉粒，而‘無核甌柑’花粉中很少；普通‘甌柑’成熟花粉粒表面積累的脂類物質(zhì)也比‘無核甌柑’多

4、；因而推測淀粉、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)積累的不足可能是‘無核甌柑’花粉不能萌發(fā)的主要原因之一。 2、對‘國慶一號’溫州蜜柑花粉育性和果實(shí)種子數(shù)進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其花粉醋酸洋紅染色活力為35％，萌發(fā)活力為零，說明其花粉是完全不育的；‘國慶一號’溫州蜜柑自然狀態(tài)下平均每果種子數(shù)為1粒，而當(dāng)用枳花粉對其進(jìn)行授粉后發(fā)現(xiàn)，其平均每果種子數(shù)增加到4粒?；ǚ蹟∮菍?dǎo)致‘國慶一號’溫州蜜柑無核的主要原因。 采用半薄切片對‘國慶一號’溫州蜜柑小孢子

5、發(fā)育過程進(jìn)行了觀察并將這一過程劃分為4個時期，即小孢子母細(xì)胞形成期、小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期、花粉粒形成期和花粉敗育期；并確定了小孢子的敗育時期最早出現(xiàn)在減數(shù)分裂期，但其大量敗育主要發(fā)生在小孢子從四分體中釋放出來之后的花粉發(fā)育早期?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂行為觀察發(fā)現(xiàn)，其減數(shù)分裂行為中期I不正常比例只占16.9％，后期I全部正常，說明其減數(shù)分裂基本正常，進(jìn)一步證實(shí)了‘國慶一號’小孢子的敗育時期主要發(fā)生在減數(shù)分裂之后的花粉發(fā)育早期。而TUNEL檢

6、測發(fā)現(xiàn)，在‘國慶一號’溫州蜜柑花粉敗育時期的花藥絨氈層細(xì)胞中檢測到DNA損傷信號；同時在四分體時期的母細(xì)胞中也出現(xiàn)DNA損傷，并且在從四分體中釋放出來的小孢子中大量檢測到DNA損傷信號。說明在‘國慶一號’溫州蜜柑的絨氈層和小孢子發(fā)育過程中可能存在著細(xì)胞程序性死亡現(xiàn)象。 3、根據(jù)線粒體基因的高度保守區(qū)段序列設(shè)計(jì)引物，從‘國慶一號’溫州蜜柑中擴(kuò)增得到三個線粒體基因片段Citatp6，Citcob和CitcoxⅡ，序列比對分析發(fā)現(xiàn)它們

7、與其他10余種植物中的atp6，cob和coxⅡ基因分別具有85％，98％和96％的同源性；Southem雜交發(fā)現(xiàn)它們在柑橘中為多拷貝。 RT-PCR和Northern雜交發(fā)現(xiàn)Citatp6，Citcob和Citcoxll的表達(dá)模式相似，都是在‘國慶一號’溫州蜜柑葉片和減數(shù)分裂時期的花蕾中大量表達(dá)；Citcob只產(chǎn)生一個轉(zhuǎn)錄本，而Citatp61和CitcoxⅡ產(chǎn)生兩個轉(zhuǎn)錄本。RNA原位雜交結(jié)果進(jìn)一步表明Citatp6、Citc

8、ob和CitcoxⅡ表達(dá)規(guī)律相似，在花粉母細(xì)胞中的表達(dá)很低，在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時期表達(dá)不斷增強(qiáng)，四分體時期的小孢子母細(xì)胞中達(dá)到最強(qiáng)，在釋放的小孢子中逐漸減弱，在成熟以及敗育的花粉中不再表達(dá)；在絨氈層中的表達(dá)也具有特異性，也是在四分體時期達(dá)到最高，在小孢子形成時期顯著降低，最后在成熟以及敗育的花粉時期檢測不到表達(dá)。推測線粒體基因在‘國慶一號’溫州蜜柑花藥中的特異性表達(dá)可能改變了其雄配子發(fā)育過程的線粒體呼吸狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致其雄性不育。

9、 4、采用細(xì)胞學(xué)、組織化學(xué)等方法對四個不同育性柑橘品種‘耐濕臍橙’、‘國慶一號’、‘華農(nóng)本地早’橘和‘HB’柚進(jìn)行了對比研究。研究發(fā)現(xiàn)‘耐濕臍橙’只形成胞原細(xì)胞，隨后開始降解，以致花藥敗育無花粉產(chǎn)生；其他品種小孢子都經(jīng)歷減數(shù)分裂過程形成花粉粒，但不育品種‘國慶一號’在小孢子從四分體中釋放出來后大量敗育；組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)在可育成熟花粉中含大量淀粉粒，花粉表面積累大量脂類物質(zhì)，而不育花粉相應(yīng)積累較少；對不同時期花藥POD同工酶電泳發(fā)現(xiàn)，在