重組幽門螺桿菌過氧化氫酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜的保護(hù)作用.pdf

1、背景與研究目的作者所在既往研究中克隆了制備了重組幽門螺桿菌過氧化氫酶(recombinant helicobacter pylori catalase,rHpCAT),活性遠(yuǎn)較常用的牛肝過氧化氫酶為高.該研究探討了該酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠腸炎的治療作用與分子機(jī)制.內(nèi)容包括: 1.rHpCAT對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸粘膜損害的保護(hù)作用;2.rHpCAT對(duì)腸粘膜細(xì)胞凋亡的影響;3.rHpCAT對(duì)腸粘膜細(xì)胞COX-2表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活的影響.

2、方法1.用三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid ,TNBS)制備SD大鼠實(shí)驗(yàn)性腸炎模型.隨機(jī)分成5個(gè)組:正常對(duì)照組:飼以常規(guī)鼠糧,不作任何處理;模型組:用TNBS誘導(dǎo)制作成腸炎模型后,不作其他干預(yù);5-氨基水揚(yáng)酸(5-Aminosalicvlic acid,5-ASA)治療組:大鼠制模后,用5-ASA灌腸干預(yù);rHpCAT治療組:大鼠制模后,用rHpCAT灌腸干預(yù);rHpCAT預(yù)防組:在大鼠制模前,先

3、用rHpCAT灌腸干預(yù)一周,大鼠TNBS誘導(dǎo)制模后,處理方法同rHpCAT處理組.在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn),用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡等觀察各組大鼠結(jié)腸粘膜的形態(tài)學(xué)變化.2.用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)和Hoechst 33258熒光染色標(biāo)記法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠結(jié)腸粘膜細(xì)胞的凋亡指數(shù).3.用免疫組化、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和免疫印跡法(western blotting)檢測(cè)環(huán)氧化酶2(COX-2)在各實(shí)驗(yàn)組大鼠結(jié)腸

4、粘膜的表達(dá)情況.4.用電泳遷移率(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)檢測(cè)環(huán)氧合酶2基因源核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factore κB,NF-κB)在各實(shí)驗(yàn)組大鼠結(jié)腸粘膜上皮的激活情況.5.用腸粘膜細(xì)胞LOVO細(xì)胞和SW480細(xì)胞體外制作氧化應(yīng)激模型,用HpCAT干預(yù),用2 ′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCF-DA)標(biāo)記各處理

5、組的細(xì)胞,在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組腸粘膜細(xì)胞活性氧產(chǎn)生情況.結(jié)論1.rHpCAT能有效改善實(shí)驗(yàn)性腸炎大鼠的腸粘膜炎性損害,對(duì)腸粘膜具有保護(hù)作用,其效果與傳統(tǒng)藥物5-ASA相近或更好.2.rHpCAT能夠抑制實(shí)驗(yàn)性腸炎大鼠腸粘膜細(xì)胞的凋亡,其中預(yù)處理組效果最佳,這可能是rHpCAT保護(hù)腸粘膜與抗炎的主要原因.3.rHpCAT能明顯抑制腸粘膜細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性ROS,下調(diào)腸粘膜上皮的COX-2表達(dá),抑制NF-κB激活,這可能是rHpCAT抗炎