丙酯草醚的AHAS作用靶標(biāo)及微粒體代謝研究.pdf

1、2-嘧啶氧基-N-芳基芐胺類衍生物是我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、自行創(chuàng)制的一類具高效除草活性的農(nóng)藥先導(dǎo)化合物，具有國(guó)際原創(chuàng)性。丙酯草醚是該類化合物中已成功開發(fā)的一種新型高效油菜田除草劑。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)丙酯草醚的除草形式及其對(duì)作用靶標(biāo)的抑制作用、除草選擇性的代謝基礎(chǔ)等尚缺乏必要的研究。明確丙酯草醚除草形式對(duì)作用靶標(biāo)的抑制作用，闡明丙酯草醚在植物體內(nèi)的代謝途徑，尤其是其增、脫毒途徑，對(duì)于明確其除草作用機(jī)理至關(guān)重要。 本文旨在研究丙酯草醚

2、及其可能的代謝產(chǎn)物對(duì)AHAS的抑制作用及其在微粒體中的代謝作用。主要研究結(jié)果如下： 1、以油菜葉片和子葉為試材，對(duì)乙酰乳酸合酶(AHAS)部分純化及活性測(cè)定的條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)不同飽和濃度硫酸銨(25％-50％，5％-15％-40％，15％-40％)及PEG(W/W，5％-15％)分級(jí)沉淀AHAS并比較不同反應(yīng)時(shí)間的酶活力大小，確定以下酶部分純化與測(cè)定條件能得到較高的酶比活力，且步驟相對(duì)簡(jiǎn)單：硫酸銨飽和濃度15.40％分級(jí)沉淀

3、，酶促反應(yīng)時(shí)間為30min，反應(yīng)溫度37℃。 由于分離過(guò)程中酶活力損失較大，試圖通過(guò)梯度離心法分離葉綠體來(lái)進(jìn)一步純化AHAS的效果并不理想。 2、支鏈氨基酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用是植物AHAS的特征，在多次提取不同植物材料AHAS過(guò)程中注意到，三種支鏈氨基酸對(duì)AHAS酶活力的抑制作用根部的總是小于來(lái)自葉片的酶，這與早期文獻(xiàn)報(bào)道的植物中存在負(fù)反饋抑制差異很大的AHAS同工酶相一致，由此推測(cè)根部AHAS可能代表一種對(duì)支鏈氨基酸不敏

4、感的AHAS同工酶。第二種可能是在提取過(guò)程中可能發(fā)生了酶蛋白的部分降解，改變了酶對(duì)支鏈氨基酸的敏感性，或者是AHAS(粗)酶測(cè)定中有其它干擾因子。針對(duì)第二種可能性，我們通過(guò)加入蛋白酶抑制劑DPDS對(duì)提取過(guò)程中酶活性及其負(fù)反饋抑制的變化情況進(jìn)行了分析。初步結(jié)論是蛋白水解不是造成根葉來(lái)源AHAS負(fù)反饋差異的主要原因，根部存在對(duì)支鏈氨基酸不敏感的丙酮酸脫羧酶干擾了AHAS酶活性可能是其主要原因。 3、以油菜和玉米葉片為試材，研究丙酯草

5、醚及其推測(cè)代謝產(chǎn)物對(duì)AHAS的抑制作用。具有“嘧啶-氧-苯”母核結(jié)構(gòu)的嘧啶水楊酸類化合物A能強(qiáng)烈抑制酶活性，其余包括丙酯草醚及其重排產(chǎn)物在內(nèi)的7種化合物均無(wú)效。這與報(bào)道的丙酯草醚為前體除草劑的結(jié)果一致，但丙酯草醚在植物體內(nèi)是否先轉(zhuǎn)化成嘧啶水楊酸類化合物再發(fā)揮其除草作用有待于進(jìn)一步研究。 4、通過(guò)根長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)法，研究10個(gè)小麥品種對(duì)丙酯草醚的敏感性。在20μm丙酯草醚的作用下，By535受到的抑制作用最明顯，達(dá)到了62.4％(扣除溶劑影響)；

6、抑制率最低的為臨麥2號(hào)和泰山23＃，分別為38.7％、40.7％(扣除溶劑影響)。 5、從經(jīng)5％乙醇和10mM丙酯草醚誘導(dǎo)的小麥黃化苗地上部制備微粒體，研究[c環(huán)-u-<'14>C]丙酯草醚在小麥微粒體中的代謝作用。HPLC-MS鑒定了3種標(biāo)記產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，獲知丙酯草醚在小麥微粒體的作用下進(jìn)行了芳環(huán)的羥基化作用，微粒體反應(yīng)體系也可能有助于丙酯草醚的異構(gòu)化，在微粒體中丙酯草醚的代謝可能與Smiles重排反應(yīng)有關(guān)。但丙酯草醚在植物