VEGF和HO-1轉(zhuǎn)染EPC治療大鼠后肢缺血的研究.pdf

1、目前下肢缺血性疾病已經(jīng)成為危害人類(lèi)健康的嚴(yán)重疾病之一，針對(duì)該疾病的主要治療手段有藥物、外科手術(shù)和血管腔內(nèi)治療等。但是對(duì)于遠(yuǎn)端流出道嚴(yán)重狹窄的患者目前還缺乏令人滿(mǎn)意的治療方法。應(yīng)用各種方法和手段促進(jìn)新生血管生成，加快缺血肢體側(cè)枝循環(huán)的建立，是有效可行的研究方向之一。 內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是在特定條件下可以分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有促進(jìn)機(jī)體血管生成的功能。1997年，Asahara等從外周血中分離出CD34+細(xì)胞，在體外將

2、其誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮細(xì)胞，植入動(dòng)物后肢缺血模型中局部形成新生血管。因而獲取EPCs并誘導(dǎo)分化，移植到缺血部位形成新生血管，治療缺血性疾病如心肌梗死、動(dòng)脈硬化閉塞癥、糖尿病足等引起了人們的廣泛興趣。由于EPCs在體內(nèi)數(shù)量有限，所以如何減少EPCs用量，獲得更好的臨床效果成為目前研究的重點(diǎn)。 研究表明結(jié)合基因治療是解決這一問(wèn)題的出路。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在治療缺血性疾病中的作用已經(jīng)得到肯定，它能增加小血管的通透性、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增

3、殖和遷移，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并能刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活物，從而有力地促進(jìn)血管新生。近年來(lái)血紅素氧合酶-1(HO-1)在血管系統(tǒng)中的作用逐漸被人們所重視，并已成為目前相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，HO-1蛋白在降低機(jī)體缺血時(shí)的損傷有重要作用，HO-1可催化血紅素形成膽綠素(膽綠素快速還原為膽紅素)，釋放鐵和一氧化碳(CO)，是血紅素代謝的限速酶。CO具有調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板聚集和抗心肌缺血再灌注損傷等效應(yīng)，膽綠素進(jìn)一步經(jīng)膽綠素還原酶作用生

4、成膽紅素，其抗氧化能力甚至超過(guò)了維生素E和維生素C，能清除體內(nèi)過(guò)量的自由基，保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激的損傷作用，HO-1降解血紅素形成的鐵離子還能誘導(dǎo)鐵蛋白的合成，鐵蛋白亦有抗氧化損傷和細(xì)胞保護(hù)功能。HO-1及其酶解產(chǎn)物一起組成強(qiáng)大的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)，在防治多種心血管疾病中均發(fā)揮著積極的作用。近年來(lái)在轉(zhuǎn)基因方面取得的進(jìn)步也表明HO-1是基本的內(nèi)源性細(xì)胞防御系統(tǒng)，具有保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、抗氧化的作用，Melo等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HO-1基因可使結(jié)扎冠狀動(dòng)

5、脈后的左室心梗面積縮小75％以上，顯示HO-1具有抗心肌缺血壞死的功能。同時(shí)其他實(shí)驗(yàn)表明HO-1還可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，對(duì)血管損傷修復(fù)有重要作用。 本研究從大鼠骨髓細(xì)胞中利用VEGF成功誘導(dǎo)分化成EPCs，并將鼠VEGF和HO-1基因轉(zhuǎn)入EPCs，比較單用EPCs、轉(zhuǎn)染VEGF的EPCs、轉(zhuǎn)染HO-1的EPCs和聯(lián)合使用轉(zhuǎn)染VEGF和HO-1的EPCs治療缺血大鼠后肢的效果： 目的：使用VEGF和HO-1轉(zhuǎn)染EPCs治

6、療大鼠缺血后肢，了解EPCS、VEGF轉(zhuǎn)染EPCS、HO-1轉(zhuǎn)染EPCS及聯(lián)合使用VEGF和HO-1轉(zhuǎn)染EPCS對(duì)大鼠缺血后肢的新生血管和肢體成活的影響，旨在為臨床基因與干細(xì)胞的治療應(yīng)用提供依據(jù)。 方法：制作90只SD大鼠后肢缺血模型，將動(dòng)物隨機(jī)分為五組，PBS組術(shù)后即經(jīng)鼠尾靜脈注射PBS0.2 ml；EPC組術(shù)后即經(jīng)鼠尾靜脈注射EPCs懸液0.2 ml；VEGF+EPC組即經(jīng)鼠尾靜脈注射EPCs懸液0.2 ml(其中2.5×1

7、05個(gè)細(xì)胞經(jīng)VEGF基因轉(zhuǎn)染)；HO-1+EPC組經(jīng)鼠尾靜脈注射EPCs懸液0.2 ml(其中2.5×105個(gè)細(xì)胞經(jīng)HO-1基因轉(zhuǎn)染)；VEGF+HO-1+EPC組經(jīng)鼠尾靜脈注射EPCs懸液0.2 ml(其中2.5×105個(gè)細(xì)胞經(jīng)VEGF基因轉(zhuǎn)染，2.5×105個(gè)細(xì)胞經(jīng)HO-1基因轉(zhuǎn)染)。分別于術(shù)后7、14及21d進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)的觀察與檢測(cè)。觀察轉(zhuǎn)染VEGF、HO-1基因的EPCs在缺血部位的聚集和促進(jìn)新生血管形成的情況。 結(jié)果：

8、1)用密度梯度離心和貼壁法結(jié)合VEGF細(xì)胞因子體外培養(yǎng)的骨髓來(lái)源的EPCs為CD133、CD34陽(yáng)性細(xì)胞，表達(dá)VEGFR—2，F(xiàn)ITC—UEA-1雙熒光染色陽(yáng)性；2)鼠VEGF、HO-1基因測(cè)序鑒定結(jié)果分別與參考序列NM_031836和NM012580一致，并成功轉(zhuǎn)染入EPCs；3)動(dòng)物總殘肢率比較，VEGF、HO-1和VEGF+HO-1組較PBS組明顯增加的肢體恢復(fù)率(P<0.05)，其中VEGF組和HO-1組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

9、>0.05)；VEGF+HO-1組肢體恢復(fù)率優(yōu)于VEGF組和HO-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4)毛細(xì)血管密度(MVD)與PBS組相比，各時(shí)間點(diǎn)中EPC、VEGF、HO-1和VEGF+HO-1組MVD均明顯增多(P<0.05)，手術(shù)后14d和21d，VEGF+HO-1組MVD多于VEGF組和HO-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：5)缺血肢體VEGF，HO-1的表達(dá)：VEGF組的VEGF蛋白表達(dá)較PBS組、EPC組、H

10、O-1組明顯增多，與VEGF+HO-1組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HO-1組的HO-1蛋白表達(dá)較PBS組、EPC組、VEGF組明顯增多，與VEGF+HO-1組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；6)手術(shù)后7d，所有組的小鼠肢體灌注都降低：手術(shù)后14，21d，與PBS對(duì)照組相比，VEGF、HO-1和VEGF+HO-1組的血流灌注恢復(fù)明顯(P<0.01)，EPC組血流灌注較VEGF組和HO-1組少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；VEGF+HO-1組血流灌注多于V