激活型Akt1轉(zhuǎn)染大鼠胰島移植物凋亡和再血管化的實驗研究.pdf

1、目的:
　　胰島移植可以重建胰島素穩(wěn)定的內(nèi)分泌系統(tǒng)，成為糖尿病有效治療手段之一。近年來雖取得重大進(jìn)展，但是仍面臨許多問題。成功地胰島移植需要重足的胰島，但是研究證實胰島移植后早期（術(shù)后7-14d），植入胰島微循環(huán)重建完成前，胰島對面臨的各種應(yīng)激異常敏感。移植后即刻血液介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)IL-1β，TNF-α等炎癥介質(zhì)和趨化因子的釋放，持續(xù)缺血缺氧等均導(dǎo)致移植胰島早期大量凋亡失功(70％)。這其中的一半發(fā)生在術(shù)后2-3d。因此，術(shù)后早期

2、，尤其是超早期(2-3d)抑制胰島凋亡，提高內(nèi)分泌功能，促進(jìn)移植胰島再血管化，可減少供胰用量，提高移植成功率。
　　Akt（蛋白激酶B）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3-K/Akt細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵組件，許多因素可依賴PI3-K途徑使Akt活化。激活的Akt通過對含有絲氨酸/蘇氨酸殘基底物磷酸化而發(fā)揮眾多生物學(xué)功能。主要是調(diào)控Bad、Caspase9、Forkhead家族、NF-κB等多個凋亡相關(guān)家族的基因轉(zhuǎn)錄抑制細(xì)胞

3、凋亡、促進(jìn)增殖，蛋白合成。Bernal-Mizrachi和Turtle等研究中，Akt1轉(zhuǎn)基因小鼠中活化Akt1表達(dá)增加，胰島細(xì)胞團(tuán)增大了8-10倍，結(jié)果出現(xiàn)了高胰島素血癥和血糖的降低。以該小鼠建立糖尿病模型對STZ誘導(dǎo)具有較強(qiáng)的抵抗力。低氧、胰島素和生長因子等可誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致下游VEGF等血管形成基因的轉(zhuǎn)錄，內(nèi)皮細(xì)胞遷移形成新血管，此過程依賴于PI3K/Akt通路的活化。Ichiro Shiojima等研究激活的Ak

4、t不但抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡還可激活eNOS，促進(jìn)新生血管的生成。這些研究提示Akt活化能夠抑制胰島凋亡促進(jìn)增殖，但是胰島細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染激活型Akt，移植物存活和功能我們知之甚少，對胰島的再血管化的作用更未見相關(guān)報道。
　　本試驗旨在用腺病毒為載體介導(dǎo)激活型Akt1基因轉(zhuǎn)染大鼠胰島，探討在糖尿病大鼠同種胰島移植中，對移植物凋亡、功能和再血管化的影響。
　　材料與方法:
　　一、實驗動物和試劑
　　供受者均為雄性Wist

5、ar大鼠，體重供者280±20g，受者250±20g，封閉群，中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。Adv-CA-Akt1中國醫(yī)科大學(xué)器官移植實驗室惠贈。
　　二、實驗方法
　　1、STZ誘導(dǎo)1型糖尿病模型建立
　　胰島移植前10-14d鏈脲酶素(STZ)腹腔注射，化學(xué)燒灼法建立Wistar大鼠的1型糖尿病模型。
　　2、胰島分離純化的方法
　　采用明尼蘇達(dá)大學(xué)的膠原酶原位灌注的方法分離純化大鼠胰島。DTZ染色鑒定

6、并計數(shù)純度，AO/EB染色鑒定胰島活率。體外葡萄糖刺激胰島素釋放試驗檢測胰島功能。
　　3、大鼠胰島培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
　　胰島在37℃5％ CO2孵箱培養(yǎng)24h后，每孔50IEQs胰島接種于24孔培養(yǎng)板。Adv-CA-Akt1和Adv-LacZ以感染復(fù)數(shù)MOI=500轉(zhuǎn)染胰島1h，更換RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。體外實驗分3組:未轉(zhuǎn)染組為單純培養(yǎng)胰島;Adv-LacZ組:轉(zhuǎn)染Adv-LacZ的胰島;Adv-CA-Akt

7、1:轉(zhuǎn)染Adv-CA-Akt1的胰島。
　　4、流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率
　　單純胰島體外培養(yǎng)有磷酸化Akt1的表達(dá)，用Adv-CA-Akt1檢測的陽性細(xì)胞數(shù)減去空白對照組陽性細(xì)胞數(shù)計算腺病毒對胰島的轉(zhuǎn)染效率。
　　5、Western-blot檢測轉(zhuǎn)染激活型Akt1的胰島磷酸化Akt1蛋白的表達(dá)。
　　6、胰島體外功能檢測
　　3組胰島不同濃度的葡萄糖(2.8，5.5，8.3，11.1，16.7，22.2 m

8、mol/l) Kreb's-Hank's液37℃5％CO2孵育60 min，檢測培養(yǎng)液中胰島素含量。
　　7、RT-PCR檢測轉(zhuǎn)然后Akt1mRNA和胰島血管生成相關(guān)基因HIF-1和VEGFmRNA的表達(dá)
　　8、高糖培養(yǎng)檢測轉(zhuǎn)染后胰島存活和凋亡
　　利用高葡糖糖對β細(xì)胞的毒性作用，含葡萄糖（16.7mmol/L）的RPMI1640培養(yǎng)液連續(xù)對3組胰島培養(yǎng)7d，AO/EB染色檢測胰島存活，TUNEL染色檢測胰島高糖環(huán)境

9、凋亡情況。
　　9、糖尿病大鼠分組及腎被膜下同種胰島移植
　　糖尿病大鼠隨機(jī)分4組，未轉(zhuǎn)染組:僅單純胰島移植;Adv-LacZ組:移植轉(zhuǎn)染Adv-LacZ的胰島;Adv-CA-Akt1組:移植轉(zhuǎn)染Adv-CA-Akt1的胰島;每組12只，每只移植胰島300IEQs;空白對照組6只，腎被膜下注射相應(yīng)體積的PBS液20μl。術(shù)后每天斷尾采血測血糖水平。隔日眶后靜脈采血檢測空腹血清胰島素水平。術(shù)后第10天靜脈糖耐量實驗(IVGTT

10、)。
　　10、移植物組織病理學(xué)檢測
　　術(shù)后3d，除空白對照組外，移植物常規(guī)石蠟切片HE染色。腎被膜下胰島胰島素免疫組化染色及TUNEL染色觀察胰島凋亡。術(shù)后12d HE染色，新生血管內(nèi)皮標(biāo)志分子CD31免疫組化染色，鏡下計數(shù)微血管密度(MVD)。
　　11、統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、 DT

11、Z對胰島特異性染色計數(shù)分離純化胰島純度＞90％,胰島細(xì)胞的成活率＞90％。胰島素分泌指數(shù)(SI)為3.6±0.75，說明純化胰島功能良好。
　　2、胰島流式細(xì)胞儀測定腺病毒對胰島轉(zhuǎn)染效率達(dá)45％。
　　3、相比Adv-LacZ組及未轉(zhuǎn)染組，Adv-CA-Akt1組磷酸化Akt1蛋白呈明顯過表達(dá)。
　　4、同一糖濃度比較，Adv-CA-Akt1組比Adv-LacZ組和未轉(zhuǎn)染組胰島素分泌量高峰濃度超出1.5倍，差異顯著(P

12、＜0.01)。兩對照組差異無顯著性P＞0.05。
　　5、RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24h和72h Adv-CA-Akt1組的Akt1mRNA相對表達(dá)量明顯比兩對照組高(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72h Adv-CA-Akt1組HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的相對表達(dá)量比對照組升高，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　6、慢性高糖培養(yǎng)胰島存活和凋亡
　　Adv-CA-Akt1組有活性胰島＞40％，未轉(zhuǎn)染胰島和A

13、dv-LacZ胰島分散單離，多數(shù)死亡。未轉(zhuǎn)染和Adv-LacZ組胰島AI分別為48％和52％，Adv-CA-Akt1組為22％。轉(zhuǎn)染Adv-CA-Akt1使胰島細(xì)胞對抗高糖誘導(dǎo)凋亡的生存率提高了25％。
　　7、移植胰島功能
　　Adv-CA-Akt1組術(shù)后第2天空腹血糖下降血清胰島素水平上升，第5天始保持穩(wěn)定水平。未轉(zhuǎn)染組和Adv-LacZ組于術(shù)后血糖雖下降，血清胰島素水平也有所上升但速度慢且未恢復(fù)正常水平(P＜0.05）

14、。IVGTT: Adv-CA-Akt1組血糖下降較快，第60min下降至正常。未轉(zhuǎn)染組和Adv-LacZ組血糖下降慢，在60min仍未恢復(fù)其空腹水平。
　　8、移植物組織病理學(xué)檢測
　　術(shù)后3天，Adv-CA-Akt1組大鼠腎被膜下可見大量有核深染細(xì)胞，胞漿較少，排列成團(tuán)其它2組也可見類似細(xì)胞團(tuán)但細(xì)胞數(shù)少，胰島素分泌功能良好。TUNEL染色Adv-CA-Akt1轉(zhuǎn)染的胰島凋亡率減少了25％。術(shù)后12天，移植物細(xì)胞減少中央和周

15、圍被纖維組織分隔替代。Adv-CA-Akt1組見成簇內(nèi)皮染成棕黃色，形成微血管。而未轉(zhuǎn)染組和Adv-LacZ組罕見陽性染色的血管內(nèi)皮。MVD計數(shù)Adv-CA-Akt1組42.12±6.55，而LacZ組和未轉(zhuǎn)染組分別為10.12±3.2和12.44±2.16，差異明顯(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、轉(zhuǎn)染激活型Akt1可以抑制移植胰島早期凋亡失功。
　　2、轉(zhuǎn)染激活型Akt1可以提高胰島的分泌功能。
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