不同劑量的Capsazepine對LPS致大鼠發(fā)熱的影響.pdf

1、瞬時感受器電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid subfamilymember1,TRPV1)是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于細胞膜或胞內細胞器膜上的一類與多種感受功能有關的非選擇性陽離子通道蛋白,該蛋白在脊髓和腦神經細胞內表達,包括海馬、杏仁核中央、紋狀體、下丘腦、丘腦、黑質、網(wǎng)狀結構中樞神經系統(tǒng)、藍斑、小腦和下橄欖核等。TRPV1可被辣椒素,質子(pH值＜6.0),和熱(＞43℃)等多種

2、理化因素激活,激活后誘導Ca2+內流,通過增加細胞內的Ca2+濃度,調節(jié)相應的生理功能或病理機制。有研究表明,在體溫調節(jié)中樞下丘腦視前區(qū)發(fā)現(xiàn)有TRPV1的表達,我們推測TRPV1可能與下丘腦的體溫調節(jié)功能有關。
　　 LPS是最常見的外源性致熱原,能刺激人體產生內源性致熱原從而提高體溫。Capsazepine是辣椒素受體競爭拮抗劑,已廣泛應用于TRPV1通道的研究。
　　 本實驗通過采用LPS復制大鼠發(fā)熱模型,在腦室內給

3、予不同劑量的TRPV1通道阻斷劑Capsazepine,觀察發(fā)熱時相的變化、下丘腦組織中TRPV1表達量,以及細胞內鈣離子濃度的變化,以期探討TRPV1通道在機體發(fā)熱過程中的作用,并確定Capsazepine在發(fā)熱大鼠下丘腦內抑制TRPV1,進而影響機體體溫的適宜濃度,為進一步的深入研究打下基礎。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗動物及處理。
　　 1、實驗動物及飼育；
　　 選用健康雄性SD大鼠,體重

4、250～280g,基礎體溫(38.1±0.2)℃,由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。飼育室室溫(20±2)℃,相對濕度40％～60％,晝夜光照節(jié)律12h:12h,單籠飼養(yǎng),自由進食水。
　　 2、實驗分組及處理；
　　 將36只雄性大鼠隨機分成4組:(1)正常對照組(Control):6只,側腦室注射溶劑10μl(溶劑為10％無水乙醇+10％Tween80+80％生理鹽水),30min后腹腔注射生理鹽水4ml·kg-1;(

5、2)Capsazepine組(CPZ):側腦室注射CPZ10μl,劑量為0.02ml·kg-1。(3)LPS發(fā)熱組(LPS):6只,向側腦室注射溶劑10μl,30min后腹腔注射LPS4ml·kg-1。(20μg·ml-1,用生理鹽水配制)(Sigma,USA);(4)Capsazepine+LPS組(CPZ+LPS):共18只,根據(jù)CPZ劑量分為3組,即0.01mg·kg-1、0.02mg·kg-1和0.03mg·kg-1組,每組6只

6、。分別向大鼠側腦室內注射CPZ,且均調至為10μl。30min后腹腔注射LPS4ml·kg-1。
　　 3、腦室插管；
　　 用10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后,將頭部固定于立體定位儀,暴露前囟。參照大鼠腦圖譜,用探針在顱骨表面冠狀縫下0.8mm,矢狀縫旁開1.5mm處鉆孔,將外徑為1mm的引導管垂直插入一側側腦室內,深度4.0mm,用牙科水泥固定導管。
　　 4、腹腔內植入檢測體溫用無線遙測發(fā)射

7、子；
　　 大鼠在麻醉狀態(tài)下,行腹正中線行剖腹術,腹腔內植入發(fā)射子后縫合,將發(fā)射子固定于腹壁上。
　　 術后動物單籠飼養(yǎng),恢復一周后進行實驗。使用無線的BW-200數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)進行體溫測量。各組在持續(xù)檢測體溫7小時后,恢復5天,重復上述實驗,并在處理后4h處死大鼠,取出下丘腦待測。
　　 二、下丘腦細胞內鈣離子濃度([Ca2+]i)測定。
　　 分離出下丘腦組織,制備成單細胞懸液,保持細胞存活率95％以上

8、。Fura-2/AM避光孵育負載,采用日立F-4500型熒光雙波長分光光度計測定熒光值,激發(fā)波長340nm,發(fā)射波長510nm。
　　 三、Western blot檢測下丘腦組織TRPV1表達。
　　 取大鼠下丘腦組織冰浴勻漿,4℃離心(13000 g·min-1,30 min)兩次,取上清。蛋白定量后,電泳、轉膜、封閉,加兔抗大鼠TRPV1單克隆抗體(1:500),二抗為羊抗兔IgG,ECL化學發(fā)光法顯色,凝膠成像系統(tǒng)

9、分析。對照為β-actin。目的蛋白與相應β-actin的灰度比值作為該目的蛋白的相對表達量。
　　 四、數(shù)據(jù)分析。
　　 所有實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(x-±s)表示,各組均數(shù)間差異的比較應用t檢驗,,相關分析采用相關性檢驗分析完成。
　　 實驗結果：
　　 一、大鼠的體溫變化；
　　 給予大鼠腹腔注射LPS可引起體溫升高,4h左右大鼠體溫值達到高峰(1.096±0.114℃),之后體溫開始下降

10、;發(fā)熱期間LPS組在各觀察時間點與Control組間體溫變化均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 當預先經側腦室注入Capsazepine,30min后腹腔注射LPS(CPZ+LPS),大鼠體溫呈明顯升高,在4h左右體溫達到高峰。Control組及CPZ組各采樣時間點比較,體溫變化值均有顯著性升高(P＜0.01);與LPS組相比,0.02mg·kg-1劑量組和0.03mg·kg-1劑量組自2h以后,發(fā)熱過程中的各時間點△T值均

11、高于LPS組(P＜0.05),且在4～5.5h期間,體溫持續(xù)保持在高峰水平。0.01mg·kg-1劑量在發(fā)熱起始階段略高于LPS組,但各時間點△T與LPS組比較無顯著性差異(P＞0.05)。在CPZ三個劑量組中隨著CPZ給藥劑量的增加,發(fā)熱幅度呈相應增加趨勢,但在0.02mg·kg-1劑量組和0.03mg·kg-1劑量組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。
　　 Control組與CPZ組比較各時間點△T無顯著性差異(P＞0.0

12、5)。
　　 二、下丘腦神經元[Ca2+]i的變化；
　　 Control組和CPZ組下丘腦細胞內鈣離子濃度之間沒有顯著性差異。CPZ+LPS組中,0.01mg·kg-1、0.02mg·kg-1和0.03mg·kg-1劑量組下丘腦細胞內鈣離子濃度值([Ca2+]i)與LPS組比較顯著降低(P＜0.05),其中0.02mg·kg-1和0.03mg·kg-1組下丘腦細胞內鈣離子濃度下降尤為明顯。下丘腦[Ca2+]I的變化與體

13、溫的變化成正相關(r=0.942,P＜0.01)Y=133.94+72.07X。
　　 三、下丘腦組織TRPV1表達的變化；
　　 LPS組在給予LPS后4h的TRPV1表達量明顯高于Control組(P＜0.05);預先給予CPZ后再給予LPS,0.01 mg·kg-1組與LPS組的表達水平無顯著性差異,但0.02 mg·kg-1和0.03 mg·kg-1組的表達水平明顯低于LPS組(P＜0.05)
　　 結論