不同劑量地塞米松對不同誘因急性肺損傷大鼠細(xì)胞因子及NF-κB的影響.pdf

1、目的：急性肺損傷(acute lung iniury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS) 是失控的炎癥反應(yīng)，多指由嚴(yán)重的感染、創(chuàng)傷、休克等原因引起的以肺泡上皮細(xì)胞及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛損傷為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。ALI/ARDS最基本病理生理改變?yōu)榉蚊?xì)血管通透性增高所致的非心源性肺水腫、透明膜形成以及微小肺不張，繼而引起急性呼吸困難、頑固性低氧血癥、肺順應(yīng)

2、性降低等。臨床上導(dǎo)致ALI/ARDS的病因達上百種，包括肺內(nèi)肺外因素兩類。前者包括胃內(nèi)容物吸入、嚴(yán)重肺部感染、淹溺、肺創(chuàng)傷等，而后者包括膿毒癥、多發(fā)傷、體外循環(huán)、復(fù)蘇時輸液過量、重癥胰腺炎等。調(diào)查表明，膿毒癥是ALI/ARDS的首位危險因素，約有40％～50％的ARDS患者與膿毒癥有關(guān)，胃內(nèi)容物誤吸也是臨床上的重要因素，約30％ARDS與胃內(nèi)容物吸入有關(guān)。同時在一些危重患者中還同時存在兩種或多種致病因素。雖然ALI和ARDS的病因多樣，

3、但它們是嚴(yán)重?fù)p傷引起機體全身免疫炎癥反應(yīng)失控過程中的不同階段。嚴(yán)重的ALI或ALI的最終嚴(yán)重階段被定義為ARDS。 機體遭受嚴(yán)重?fù)p傷時，可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，進而導(dǎo)致多臟器功能障礙綜合征(MODS)，肺是首位靶器官，ALI或ARDS出現(xiàn)最早，是MODS的重要組成部分。“二次打擊”模式能更好地解釋SIRS怎樣發(fā)展成為MODS。 急性肺損傷實際上是一種炎癥反應(yīng)，炎癥介質(zhì)增高伴有抗炎分子表達的下降是肺部炎癥發(fā)病

4、機制的關(guān)鍵。參與炎癥的炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)構(gòu)成了ALI炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的“細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)”和“細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”，并在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)與急性肺損傷關(guān)系密切。NF-κB是控制炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子基因表達的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，它的活化及炎癥因子的過度表達可造成細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的級聯(lián)或瀑布效應(yīng)。 糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs

5、)由于其強大的抗炎和細(xì)胞效應(yīng)，在ALI/ARDS中的應(yīng)用受到廣泛重視，但糖皮質(zhì)激素抗炎作用的確切機制目前還不清楚。糖皮質(zhì)激素在治療ARDS時的應(yīng)用時機、劑量、療程在學(xué)術(shù)界爭議很大，不同劑量GCs的抗炎效應(yīng)是否有差異尚不清楚，同時激素對不同誘因ARDS患者的治療效果也存在較大差異，其具體機制有待于進一步探討。 因此，本研究復(fù)制了鹽酸(Hydrochloric acid，HCl)，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS

6、)的“一次打擊”和LPS-HCl“二次打擊”急性肺損傷(ALI)模型，比較致炎因子腫瘤壞死因子(TNF-α)、抑炎因子白介素10(IL-10)水平、核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)表達的差異，探討不同劑量地塞米松對不同病因急性肺損傷的干預(yù)效果及作用機制。 方法：健康雄性SD大鼠72只，體重250～300g，隨機分為12個組：(1)LPS組，(2)LPS+Dex1組，(3)LPS+Dex8組，(4)HCl組，(5)HCl+Dex1組，(6

7、)HCl+Dex8組，(7)LPS-HCl組，(8)LPS-HC1+Dex1組，(9)LPS-HC1+Dex8組，(10)NS組，(11)NS+Dex1組，(12)NS+Dex8組，每組6只動物。(1)(2)(3)尾靜脈注射LPS(8mg/kg)；(4)(5)(6)氣管內(nèi)緩慢滴注HC1(pH 1.8，2ml/kg)；(7)(8)(9)尾靜脈注射LPS(4mg/kg)，4小時后，氣管內(nèi)緩慢滴注HC1(pH 1.8，0.5ml/kg)；(2

8、)(5)(8)(11)為小劑量激素干預(yù)組，造模后立即腹腔注射Dex(1mg/kg)；(3)(6)(9)(12)為大劑量激素干預(yù)組，造模后立即腹腔注射Dex(8mg/kg)；(10)(11)(12)為對照組：尾靜脈注射生理鹽水0.6 ml。 模型復(fù)制后4h，10％水合氯醛腹腔注射麻醉(4ml/kg)，開胸處死動物后立即抽取心臟血液，收集血液，離心后(3000rpm，4℃，10min)，取上清，-80℃保存，檢測血清中TNF-α、I

9、L-10的含量。 取右肺前葉100 mg，提取組織核蛋白，用電泳遷移率變動分析技術(shù)(EMSA)檢測肺組織中NF-κB的相對活性。取右肺下葉，10％中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋做病理切片，通過HE染色和免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)分別觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化并評分，檢測肺組織NF-κB P65的表達。取右肺后葉及副葉進行W/D的測定(80℃，48h)。經(jīng)氣管插管行左肺支氣管肺泡灌洗，取支氣管肺泡灌洗液(BALF)，離心(1200

10、rpm，4℃，10min)，吸取上清，-80℃保存，檢測BALF中TNF-α、IL-10的含量和蛋白水平。細(xì)胞沉淀懸浮于200μl生理鹽水中，進行細(xì)胞計數(shù)。 結(jié)果： (1) 光鏡下肺組織病理評分：LPS組、HCI組和LPS-HCI組之間無明顯差別(P>0.05)。給不同劑量Dex后，LPS和LPS-HCI病理評分較相應(yīng)模型組均明顯降低(P<0.05)；HC1+Dex1明顯高于LPS+Dex1和LPS-HC1+Dex1(P

11、<0.05)。 (2)與NS組比較，LPS組、HC1組和LPS-HCI組BALF中細(xì)胞總數(shù)有明顯升高(P<0.01)。分別給予不同劑量Dex后，LPS組中BALF中細(xì)胞總數(shù)明顯減少(P<0.05)；HC1+Dex1和LPS-HC1+Dex1均比LPS+Dex1明顯升高(P<0.05)。 (3)與NS組比較，LPS組、HC1組和LPS-HC1組BALF中蛋白含量均有明顯升高(P<0.01)，且HC1組和LPS-HC1組均較

12、LPS組升高(P<0.01，0.05)。分別給予不同劑量Dex后，LPS組和LPS-HC1組中的蛋白含量均明顯降低(P<0.05)；HC1+Dex1較HC1組明顯降低(P<0.05)。 (4) 與NS組比，LPS組、HC1組和LPS-HC1組肺W/D均有明顯升高P<0.01)。分別給予不同劑量Dex后，LPS組中肺W/D明顯降低(P<0.05)；LPS-HC1+Dex1組較LPS-HC1組降低(P<0.05)。 (5)L

13、PS組、HC1組和LPS-HC1組血清和BALF中TNF-α含量顯著高于NS組(P<0.01)。分別給予不同劑量Dex后，LPS組與LPS-HC1組血清和BALF中TNF-α含量均減少(P<0.05)。 (6)LPS組、HC1組和LPS-HC1組血清和BALF中IL-10含量顯著高于NS組(P<0.01)，且HC1組BALF中IL-10比LPS和LPS-HC1組含量高(P<0.05)。分別給予不同劑量Dex后，LPS組與LPS-

14、HC1組血清和BALF中IL-10含量均增多(P<0.05)，而HC1組僅BALF中IL-10明顯升高(P<0.01)。 (7)免疫組化結(jié)果顯示，LPS組、HC1組和LPS-HC1組可見NF-κB P65表達和分布明顯多于正常組(P<0.01)，LPS組和LPS-HC1組NF-κB P65表達高于HC1組(P<0.01)，NF-κBP65 陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈強陽性，并出現(xiàn)了核移位，給Dex后，LPS組、LPS-HC1組NF-κB P

15、65表達均減少(P<0.05)，染色均明顯變淺，陽性反應(yīng)明顯減輕。 (8)EMSA結(jié)果示，LPS組、HC1組和LPS-HC1組肺組織中NF-κB水平顯著高于NS組(P<0.01)。LPS組NF-κB水平顯著高于HC1組和LPS-HC1組(P<0.01)。分別給予不同劑量Dex后，LPS組與LPS-HC1組肺組織中NF-κB水平均下降(P<0.01)，同一模型組不同劑量之間均無明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論： (

16、1)細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是ALI/ARDS的“中心環(huán)節(jié)”，不同病因下ALI/ARDS的細(xì)胞因子水平存在一定的差異，ALI,FARDS的炎癥反應(yīng)可能與病因有關(guān)。 (2) 可引起ALJ/ARDS的一次打擊及二次打擊均可誘導(dǎo)NF-κB的活化，N F-κB在ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。ALI的發(fā)病機制可能與NF-κB表達升高所致的炎癥反應(yīng)失衡有關(guān)。 (3) 糖皮質(zhì)激素可抑制ALI/ARDS的炎癥反應(yīng)，減輕肺損