犬瘟熱病毒N蛋白體外表達與診斷技術(shù)應(yīng)用研究.pdf

1、犬瘟熱(Canine distemper CD)系由副粘病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒引起犬科、鼬科等多種食肉動物的一種急性、熱性、高度接觸性的傳染病，分布范圍廣，易感動物種類多，發(fā)病率和死亡率高。 自發(fā)現(xiàn)以來，犬瘟熱一直未停止對動物健康的威脅。截至目前，世界各國凡是有犬科動物生存的地區(qū)都有本病發(fā)生，即使美、英、法、澳大利亞、新西蘭、日本等動物衛(wèi)生水平較高的發(fā)達國也不例外，我國自1968年首次在黑龍江一野生動物飼養(yǎng)場發(fā)現(xiàn)犬瘟熱，現(xiàn)

2、已蔓延到吉林、遼寧、江蘇、四川、山東、廣西等二十幾個省區(qū)。 犬瘟熱的流行與傳播嚴重地影響了經(jīng)濟動物養(yǎng)殖、野生動物保護和動物貿(mào)易的健康發(fā)展。隨著CDV對動物流行因素的不斷適應(yīng)，其自然感染宿主范圍在不斷擴大，加之CDV變異株的出現(xiàn)，犬瘟熱的發(fā)病率和致死率仍居高不下，流行趨勢由散發(fā)向群發(fā)發(fā)展，臨床癥狀越來越復(fù)雜，其危害也越來越大。特別是國寶大熊貓等珍稀動物及獼猴等靈長類動物的CDV感染，使CDV的致病地位日益突出。 此外，最新

3、研究證實CDV在體外可感染人的前體破骨細胞，在破骨細胞內(nèi)增殖，表明CDV的自然宿主可能已擴展到了人類，犬瘟熱可能是犬傳染給人的第二個病毒性傳染病。 鑒于上述因素，國際動物衛(wèi)生組織(OIE)始終將其作為重點關(guān)注的疫病之一，我國也在CD的診斷、防治等領(lǐng)域進行大量的研究。本研究由國家質(zhì)檢總局資助，在口岸動物檢疫特種經(jīng)濟動物重點試驗完成，旨在收集關(guān)于CD疫情信息、跟蹤研究進展、開發(fā)診斷技術(shù)、分析流行趨勢，為進一步研究防治措施、完善標準體

4、系奠定基礎(chǔ)，主要包括以下內(nèi)容： 1.狐源犬瘟熱病毒的分離與鑒定本研究用MDCK細胞從具有疑似犬瘟熱癥狀的病狐血液中分離到一株病毒，該病毒在MDCK細胞上生長良好，并能形成典型而規(guī)律的CPE。經(jīng)電鏡觀察、理化特性、滴度測定、動物回歸試驗、RT-PCR和熒光定量RT-PCR鑒定，證實分離到的病毒為一株犬瘟熱病毒強毒株，并命名為CDV-FOX-TA.該病毒的分離與鑒定的成功，為進一步開展狐貍?cè)翢岬木C合性防制和診斷技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)，

5、具有重要的理論價值和實踐意義。 2.根據(jù)Genbank上發(fā)表的犬瘟熱病毒(CDV)N基因核酸序列，設(shè)計、合成一對CDV N基因特異性引物，并在上下游引物分別引入酶切位點KpnⅠ/XhoⅠ，采用RT-PCR擴增出狐源CDV泰安分離株(CDV-FOX-TA)的N基因片段，純化擴增的N基因后，將其克隆入pMD18-T載體。進行測序分析，證實CDV-FOX-TA N基因含有1個ORF，全長1572bp，共編碼523個氨基酸，N蛋白含有高

6、度保守Tyr-Pro-Ala-Leu-Gly-Leu-His-Glu-Phe九肽序列，是T細胞表位，可致敏靶細胞。CDV-FOX-TA N基因與CDV疫苗株Ondersteport、Convac的N基因的同源性分別為96.0％和95.9％，與CDV野毒株N基因的同源性在98.4％-98.9％之間。對CDV N基因進行系統(tǒng)發(fā)生分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDV-FOX-TA與CDV強毒株的親緣關(guān)系較為密切。 3.根據(jù)GenBank發(fā)表的犬瘟熱病

7、毒N基因全序列，設(shè)計合成了1對特異擴增CDV N基因的引物。以山東泰安分離的CDV-FOX-TA株細胞毒中提取病毒RNA來制模板，利用RT-PCR擴增出了1.6kb的N基因，將其克隆到pIREShyg載體上，構(gòu)建了pIRES-N真核表達載體。然后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞，用潮霉素篩選得到陽性克隆。間接免疫熒光實驗(IFA)鑒定N基因在CHO細胞中的表達， RT-PCR方法則從轉(zhuǎn)錄水平證實N基因在CHO-K1細胞中的表達。CHO/

8、CDV-N細胞株的成功構(gòu)建，為進一步研究犬瘟熱血清學(xué)檢測技術(shù)和基因疫苗奠定了基礎(chǔ)。 4.RT-PCR技術(shù)擴增出犬瘟熱病毒(CDV)核衣殼(N)蛋白基因的高度保守序列后，將其TA克隆至pMD18-T載體中，再將測序正確的N基因的目的片段亞克隆到原核表達載體pET24b中6xHis Tag編碼基因的上游，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta2(DE3)株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，N基因融合蛋白獲得了高效表達。SDS-PAGE分析和Wes

9、tern blot分析的結(jié)果顯示，表達產(chǎn)物的分子質(zhì)量為15 kD，與CDV標準陽性血清呈陽性反應(yīng)，間接ELISA結(jié)果也表明重組表達產(chǎn)物具有良好的抗原性，能夠有效區(qū)分CDV標準陽性與陰性血清，表明大腸桿菌表達的CDV N蛋白在免疫原性上具有與天然N蛋白一定的相似性，可作為診斷用抗原，為下一步建立檢測CDV的間接ELISA試劑盒奠定了基礎(chǔ)。 5. 將構(gòu)建好的含重組質(zhì)粒且能正確表達N蛋白的Rosetta2(DE3)菌株中，在最佳誘導(dǎo)條

10、件下獲得重組N蛋白。隨后用鎳親和層析方法對表達產(chǎn)物進行純化，對純化效果及純化產(chǎn)物的特異性分別用SDS-PAGE電泳及Western-blot試驗檢測。在此基礎(chǔ)上，以純化的重組N蛋白作為包被抗原，對各種條件進行優(yōu)化(如抗原的包被，作用時間)，確定了判定標準，建立了檢測CDV抗體的間接ELISA方法。用此方法檢測了270份血清樣品，并與法國Synbiotics公司ELISA試劑盒檢測結(jié)果相比較，符合率達92.4％。 6.實驗選擇CD

11、V的M基因保守序列作為引物和探針并對CDV RT-PCR和Taq Man熒光定量RT-PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，建立了CDV Taq Man熒光定量RT-PCR檢測cdv技術(shù)。利用檢測系列稀釋的標準陽性樣品建立標準曲線，可對待檢樣品中病毒含量定量，精確度可達0.01 TCID20/ml，敏感性比常規(guī)的RT-PCR的方法高100倍；對Rabies virus、CPV、CAV-1和CAV-2進行檢測不產(chǎn)生擴增，具有高度特異性。C

12、DV TaqMan熒光定量RT-PCR方法在檢測CDV整個過程中從RNA提取到出現(xiàn)檢測結(jié)果只需3小時，檢測時間大大縮短。本法既可對血液、扁桃體等體內(nèi)樣品中檢測病毒，又可對尿液、結(jié)膜拭子、糞拭子等體外樣品進行檢測，樣品收集不受限制，微量樣品也可進行檢測，而且本法一次可檢測多個樣品，檢測通量高。應(yīng)用結(jié)果表明，TaqMan熒光定量RT-PCR與RT-PCR和電鏡觀察的符合率高，具有準確定量、靈敏度高和特異性強、降低污染以及省時省力等優(yōu)點，且提