樹突狀細(xì)胞在干擾素聯(lián)合供體淋巴細(xì)胞輸注治療移植后白血病復(fù)發(fā)中增強(qiáng)抗白血病效應(yīng)機(jī)制的體外研究.pdf

1、目的:1.建立與細(xì)胞因子干擾素-α(IFN-α)活化的供體淋巴細(xì)胞輸注(aDLI)相對(duì)應(yīng)的IFN-樹突狀細(xì)胞(IFN-DC)以及傳統(tǒng)的白介素-4-DC(IL-4-DC)兩組DC體外培養(yǎng)體系;2.比較分析兩個(gè)DC培養(yǎng)體系中DC生物學(xué)特征以及功能差異;3.初步闡明aDLI中IFN-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-DC與aDLI抗白血病效應(yīng)增強(qiáng)之間的相關(guān)性。
　　方法:1、兩組體外DC(即IFN-DC與IL-4-DC)的培養(yǎng):采集正常供體粒系-細(xì)胞

2、集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員后的外周血干細(xì)胞(PBSC),Ficoll法分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。磁珠分選獲得CD14+單核細(xì)胞,根據(jù)不同培養(yǎng)體系分成兩組:對(duì)照組(IL-4-DC組):粒系巨核系-細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)聯(lián)合白介素-4(IL-4)誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞分化成DC,誘導(dǎo)第5天加入腫瘤壞死因子-α(TNF-α)促進(jìn)DC的成熟,并于第7天收獲IL-4-DC;實(shí)驗(yàn)組(IFN-DC組):GM-CSF聯(lián)合IFN

3、-α誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞分化成DC,并于第3天收獲IFN-DC。2、比較兩組DC的生物學(xué)特征:通過流式FCM檢測(cè)兩組DC免疫表型(CD14,CD83,CD56,CD11c,CD123,CD209,CD40,CD80,CD86,HLA-DR);混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測(cè)定DC刺激淋巴細(xì)胞增殖能力;Real Time RT-PCR檢測(cè)兩組DC溶酶相關(guān)性膜蛋白(DCLAMP)mRNA的表達(dá)情況;采用transwell小室法測(cè)定兩組DC的遷

4、移能力,Real Time RT-PCR檢測(cè)趨化因子受體CCR7 mRNA水平。3、IFN-DC的功能研究:a.IFN-DC的直接細(xì)胞殺傷效應(yīng):將K562細(xì)胞與IFN-DC混合培養(yǎng)后,采用LDH釋放試驗(yàn),測(cè)IFN-DC的直接細(xì)胞殺傷率％;b.IFN-DC激活淋巴細(xì)胞引發(fā)的特異性的細(xì)胞殺傷效應(yīng):制備SHI-1細(xì)胞株凍融抗原并負(fù)載兩組培養(yǎng)體系DC,用抗原負(fù)載DC刺激供體T細(xì)胞,再與SHI-1細(xì)胞株混合培養(yǎng),采用LDH釋放試驗(yàn),測(cè)T細(xì)胞的細(xì)胞

5、殺傷率％。
　　結(jié)果:1.經(jīng)GM-CSF/IFN-α以及GM-CSF/IL-4/TNF-α誘導(dǎo)分化的DC具有明顯的細(xì)胞突起,具備典型DC形態(tài);2.初步流式結(jié)果顯示IFN-DC以及IL-4-DC較誘導(dǎo)前CD14表達(dá)量迅速下調(diào),同時(shí)表達(dá)較高CD83,CD11c,CD123,CD209,CD40,CD80, CD86,HLA-DR;3.IFN-DC與IL-4-DC是兩組不同的DC,二者免疫表型存在差異:CD14(81.55±1.23％v

6、s6.80±1.80％,p=0.000),CD209(44.08±5.02％vs95.02±5.76％, p=0.002), CD40(94.29±3.69％vs70.53±2.43％, p=0.001), CD80(30.67±3.82％vs83.38±12.71％,p=0.005),CD86(85.34±5.25％vs70.16±8.25％,p=0.023);4.Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IFN-DC較IL-4-DC的趨化

7、能力更強(qiáng),遷移指數(shù)(3.55±0.45) vs(2.53±0.18),p<0.05,進(jìn)一步Real Time RT-PCR結(jié)果表明IFN-DC的CCR7 mRNA表達(dá)量較IL-4-DC高,p<0.05;5.Real Time RT-PCR結(jié)果表明IFN-DC的DC-LAMP mRNA表達(dá)量也較IL-4-DC高,p<0.05;6.混合淋巴反應(yīng)(MLR)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在各比例條件下IFN-DC刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力較IL-4-DC刺激淋巴細(xì)胞

8、增殖的能力有增強(qiáng)趨勢(shì);7.乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)表明兩組DC負(fù)載凍融抗原刺激自體淋巴細(xì)胞后均有明顯的細(xì)胞殺傷效應(yīng)。
　　結(jié)論:1.成功建立了IFN-DC以及IL-4-DC兩個(gè)體外DC培養(yǎng)體系;2.IFN-DC與IL-4-DC是兩組不同群體的DC;3.IFN-DC較IL-4-DC有更強(qiáng)的遷移能力以及抗原提呈能力;4.各比例條件下IFN-DC刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力較IL-4-DC刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力有增強(qiáng)趨勢(shì),同時(shí)抗原負(fù)載的IFN-DC