食管癌高發(fā)區(qū)食管-賁門雙源癌(同一個體)流行病理特征及血清microRNA表達.pdf

1、1研究背景與目的
　　 食管癌是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一，顯著的地域性分布差異以及與賁門腺癌高發(fā)區(qū)并存是其突出的流行病學特征。在中國食管癌高發(fā)區(qū)，食管癌主要組織類型為鱗癌，與賁門腺癌同時高發(fā)，提示兩者可能具有相似的致癌因素和發(fā)病機制，本實驗室10余年現場研究發(fā)現，食管鱗癌和賁門腺癌存在于同一個體的情況并非罕見，將其定義為同一個體同時或先后發(fā)生食管鱗癌和賁門腺癌，簡稱雙源癌。本文旨在闡明食管癌高發(fā)區(qū)雙源癌流行病理特征，為腫瘤

2、防治工作提供流行病學依據。
　　 據文獻報道及本實驗室研究結果，雙源癌漏診情況嚴重，預后差，對于本病除了在臨床實踐中提高警惕性以外，探討發(fā)病機制和尋找特異的腫瘤標記物，將有助于早期診斷和治療，改善患者預后。
　　 研究發(fā)現miRNA是一大類基因表達調控因子，起著癌基因或抑癌基因的作用，調節(jié)大約1/3的人類基因。目前已進行各種腫瘤的miRNA表達研究，并取得了令人鼓舞的成績，miRNA對腫瘤發(fā)病機制的探討和發(fā)現干預治療的新

3、分子靶標必將起到一個非常重要的作用，同時可以作為一個腫瘤診斷標記物加以開發(fā)和利用。
　　 越來越多的文獻報道血液和組織miRNA表達譜可以用來區(qū)分腫瘤和正常對照，如有文獻報道m(xù)iRNA可以作為乳腺癌的生物標記物，在檢測腫瘤、指導預后和個體化治療方面有一定的臨床價值。我們假定雙源癌病人血清中也存在特定miRNA表達譜，能夠在診斷雙源癌和探討發(fā)病機制中起一定作用。血液中miRNA在癌癥的非侵入性診斷標記物的探索中有著廣闊的前景，我們

4、通過目前比較成熟的芯片技術來研究雙源癌血清miRNA表達，探索miRNA在雙源癌中的診斷和發(fā)病機制中的意義。
　　 2材料與方法
　　 2.1研究對象
　　 采用問卷調查、家訪、醫(yī)院病案資料整理分析及病理學檢查等方法，對豫北地區(qū)及河北磁縣的雙源癌病人資料進行收集整理，共收集431例雙源癌病人資料，資料主要來源于當地數家醫(yī)院及相關腫瘤登記機構，所有病人均經組織病理學證實。
　　 選取本實驗室收集的林州地區(qū)4

5、722例單發(fā)食管癌和賁門癌手術切除標本，將每例標本進行連續(xù)取材，全部石蠟包埋，每個蠟塊均進行切片、HE染色，再次鏡下觀察、記錄，篩選漏診的雙源癌，共檢出112例，加上首次診斷的431例雙源癌病人，共有543例，將所有收集到的臨床資料錄入Excel表，使用SPSS15.0統計軟件包進行統計學處理，檢驗水準采用α=0.05。
　　 挑選豫北地區(qū)和河北磁縣臨床資料齊全的5例雙源癌、14例食管癌、13例賁門癌病人和16例正常對照血清標本

6、，全部研究對象取清晨空腹非抗凝靜脈血5mL，靜置30min后，4℃1600轉離心5分鐘分離血清，將血清放置EP管-20℃保存待用。根據提取的miRNA量，部分樣品做了技術重復以進一步消除隨機誤差。
　　 2.2 miRNA表達譜芯片雜交
　　 采用蛋白酶K消化法抽提血清總RNA，通過乙醇沉淀法分離小分子RNA，將分離出的小分子RNA與AFFY miRNA表達譜芯片進行雜交，將芯片清洗、染色后掃描。
　　 應用軟件

7、Affymetrix(?) GeneChip(?) Command ConsoleTM1.1將掃描得到的原始數據進行分析處理：本次數據分析所用到的相關軟件：SAM軟件；監(jiān)督聚類分析和結果展示軟件；miRNA芯片歸一化分析及質控軟件。
　　 3結果
　　 3.1雙源癌的病理流行特征
　　 雙源癌男：女=5.12:1，高發(fā)年齡60-70歲。雙源癌中食管鱗癌和賁門腺癌均是Ⅱ期居多(55.56％、36.17％)；食管鱗癌

8、以中分化為主(62.81％)，而賁門腺癌以低分化為主(48.41％)；食管鱗癌發(fā)病部位以中段居多(66.67％)；食管鱗癌以髓質型和早期癌比例最高(均為33.07％)，賁門腺癌以蕈傘型(29.92％)居多。雙源癌病人進行家族史調查的共152例，其中男性132例，家族史陽性57例，陰性75例，女性20例，陽性4例，陰性16例，雙源癌家族史陽性率40.13％，男性高于女性(43.18％vs20.00％P=0.049)。共隨訪雙源癌病人124

9、例，失訪10例，有效隨訪114例，其中男性99例，中位生存時間36.70月，女性15例，中位生存時間22.00月(P=0.263＞0.05)；有隨訪資料并進行家族史調查的病人106例，陽性患者中位生存時間29.75月，陰性患者中位生存時間41.30月(P=0.424)。雙源癌5年生存率17.54％，男女兩組及家族史陽性和陰性兩組生存率均無統計學意義。
　　 3.2雙源癌血清miRNA表達譜
　　 3.2.1雙源癌與正常對

10、照比較篩選的結果
　　 采用SAM軟件對2組芯片數據(包括生物學重復和技術重復)進行差異表達miRNA的篩選，篩選標準為：信度判斷(P-value)控制在5％以內，同時差異倍數在1.5倍以上，即Fold Change＞1.5為上調，Fold Change≤0.667為下調。雙源癌組與正常對照組比較篩選到12個表達上調的miRNA，分別為miR-320b、miR-320c、miR-320a、miR-92a、miR-486-5p、m

11、iR-627、miR-365、miR-1826、miR-923、miR-185、miR-129-star和miR-106a-star，上調倍數1.5192-3.8319。
　　 3.2.2雙源癌組與食管癌組比較篩選的結果
　　 雙源癌組與食管癌組比較篩選出12表達上調的miRNA，分別為miR-320b、miR-320c、miR-320a、miR-92a、miR-486-5p、miR-627、miR-365、miR-18

12、26、miR-185、miR-129-star、miR-558、miR-629-star，上調倍數1.5162-3.7357;miR-1184表達下調，倍數為0.5927。
　　 3.2.3雙源癌組與賁門癌組比較篩選的結果
　　 雙源癌組與賁門癌組比較共篩選出11個表達上調的miRNA，分別為miR-320b、miR-320c、miR-320a、miR-92a、miR-486-5p、miR-638、miR-627、miR

13、-365、miR-1826、miR-923、miR-149-star，上調倍數1.5505-6.1185。
　　 4結論
　　 雙源癌漏診情況嚴重，發(fā)病以男性為主，高發(fā)年齡60-70歲，男性家族史陽性率高于女性，5年生存率低，預后較差。miR-320b、miR-320c、miR-320a、miR-92a、miR-486-5p、miR-627、miR-365和miR-1826等miRNA在雙源癌中較對照組明顯上調表達，可能