HBx抑制RASSF1A表達(dá)參與肝癌發(fā)生可能機(jī)制的研究.pdf

1、目的:分析肝癌組織中RASSF1A的表達(dá)趨勢及乙肝病毒（Hepatitis BVirus，HBV）的關(guān)鍵基因HBx對RASSF1A的表達(dá)影響。
　　方法:應(yīng)用RT-PCR（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Fluorescent Quantitative RT-PCR)方法，在RNA水平分析了肝癌病例組織、正常肝永生化細(xì)胞系和肝

2、癌細(xì)胞系中抑癌基因RASSF1A的表達(dá)情況。應(yīng)用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)方法分析了RASSF1A在細(xì)胞中的表達(dá)部位。在HBx表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的正常肝永生化細(xì)胞系L02、肝癌癌旁細(xì)胞系QSG-7701和肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中，應(yīng)用RT-PCR方法檢測了RASSF1A在HBx轉(zhuǎn)染前后的表達(dá)變化。以DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5'-Aza處理表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞系MHCC-97H，檢測DNA甲基化作用是否

3、參與調(diào)控了RASSF1A的表達(dá)。運(yùn)用甲基化特異性PCR(Methylated Specific PCR，MSP)方法檢測了HBx轉(zhuǎn)染前后L02和QSG-7701細(xì)胞系RASSF1A基因的啟動子區(qū)DNA甲基化情況。用RT-PCR的方法檢測了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DNMT1 siRNA和DNMT3B siRNA的肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中RASSF1A的表達(dá)情況，以確認(rèn)何種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶了參與了RASSF1A的表達(dá)調(diào)控。應(yīng)用亞硫酸氫鹽基因組測序法(

4、Bisulfite Genomic Sequencing，BGS)分析抑制DNMT1后RASSF1A啟動子區(qū)CpG位點(diǎn)的DNA甲基化程度。
　　結(jié)果: RASSF1A在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中呈表達(dá)下調(diào)趨勢。在肝癌組織中，RASSF1A在RNA水平的低表達(dá)率為48％。免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示，RASSF1A在肝細(xì)胞核中表達(dá)。在轉(zhuǎn)染了HBx表達(dá)載體的正常肝永生化細(xì)胞系L02，肝癌癌旁細(xì)胞系QSG-7701和肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中

5、，HBx的轉(zhuǎn)染下調(diào)了RASSF1A的表達(dá)，同時(shí)，DNMT1和DNMT3B表達(dá)上升。以5'-Aza處理表達(dá)HBx的細(xì)胞系MHCC-97H，RASSF1A的表達(dá)回復(fù)，提示DNA甲基化參與調(diào)節(jié)RASSF1A的表達(dá)。HBx轉(zhuǎn)染沒有改變RASSF1A啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)，但影響了個(gè)別CpG位點(diǎn)的甲基化程度。HBx上調(diào)了肝癌細(xì)胞中DNMT1和DNMT3B，而抑制DNMT1誘導(dǎo)了RASSF1A表達(dá)，提示HBx抑制RASSF1A的表達(dá)可能與DNMT