輔助性T細(xì)胞亞群在EAE小鼠早期視神經(jīng)炎發(fā)病中的作用及β-欖香烯干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、視神經(jīng)炎(optic neuritis,ON)是神經(jīng)眼科臨床最常見的疾病之一,是累及視神經(jīng)的急性或亞急性炎癥,原發(fā)性或特發(fā)性脫髓鞘性視神經(jīng)炎(idiopathicdemyelinated optic neuritis,IDON)是臨床最為常見的類型,該類型的視神經(jīng)炎和MS的發(fā)病密切相關(guān),二者有共同的病理改變。流行病學(xué)研究表明70％的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)病人存在視神經(jīng)炎,10-20％的MS病人臨床首發(fā)癥

2、狀為視神經(jīng)炎。特發(fā)性脫髓鞘性視神經(jīng)炎的發(fā)病和MS一樣呈逐年上升趨勢(shì),其治療現(xiàn)狀不容樂觀。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental allergicencephalomyelitis,EAE)動(dòng)物模是研究MS發(fā)病機(jī)制及治療最理想的動(dòng)物模型。β-欖香烯是我國自行開發(fā)研制的國家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物,具有免疫調(diào)節(jié)的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)欖香烯對(duì)多種腫瘤有確切的療效,并且易于通過血腦屏障。鑒于ON的病理機(jī)制可能涉及與腫瘤相似的免疫調(diào)節(jié)紊

3、亂,因此本研究通過髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白多肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide35-55,MOG35-55)誘發(fā)的EAE小鼠模型來探索ON發(fā)病的神經(jīng)免疫學(xué)機(jī)制及β-欖香烯的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制,為視神經(jīng)炎的基礎(chǔ)研究和臨床視神經(jīng)炎的治療提供新的方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分，MOGEAE小鼠早期視神經(jīng)的病理學(xué)改變及及軸索損傷的研究
　　 目的：
　　 采用公認(rèn)的M

4、OG35-55誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型,觀察EAE小鼠視神經(jīng)早期病理學(xué)變化,為脫髓鞘性視神經(jīng)炎的研究建立實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　 方法：
　　 使用人工合成的MOG35-55多肽在百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)和完全福氏佐劑(complete Fretmd’s Adjuvant,CFA)輔助下免疫雌性C57BL/6小鼠制作EAE模型,觀察模型的行為學(xué)變化(體重和臨床評(píng)分)、組織學(xué)變化

5、(蘇木素-伊紅染色、透射電鏡)和免疫組織化學(xué)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、行為學(xué)改變:免疫后14天左右,小鼠逐漸出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙,評(píng)分開始上升,在觀察期內(nèi),小鼠體重總體趨勢(shì)向上,臨床癥狀明顯時(shí),體重也隨之波動(dòng)出現(xiàn)小幅下降。
　　 2、形態(tài)學(xué)改變:免疫后7天、11天、15天、19天小鼠視神經(jīng)逐漸出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)及軸索髓鞘的不同程度的損傷。
　　 3、免疫組織化學(xué)的改變:免疫后7天小鼠可見視神經(jīng)軸索損傷(

6、β-APP蛋白表達(dá),與對(duì)照組比較,p<0.05),免疫后11天β-APP蛋白表達(dá)明顯(與對(duì)照組比較,p<0.05),免疫后11天可見視神經(jīng)髓鞘損傷(CNPase蛋白表達(dá)減少,與對(duì)照組比較,p<0.05),免疫后15天CNPase蛋白表達(dá)明顯減少(與對(duì)照組比較,p<0.05),發(fā)病高峰期可見明顯的軸索髓鞘損傷(與對(duì)照組比較均p<0.05)。
　　 第二部分，MOGEAE小鼠早期視神經(jīng)輔助性T細(xì)胞因子及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)時(shí)程
　

7、　 目的：
　　 研究輔助性T細(xì)胞亞群Th1、Th2、Treg、Th17特異性細(xì)胞因子其轉(zhuǎn)錄因子在脫髓鞘性視神經(jīng)炎早期發(fā)病中的表達(dá)時(shí)程,以明確EAE小鼠脫髓鞘性視神經(jīng)炎的免疫反應(yīng)啟動(dòng)及免疫炎癥維持機(jī)制。
　　 方法：
　　 通過ELISA、免疫組化及ReaL-time PCR技術(shù)觀察不同時(shí)點(diǎn)(免疫后7天、11天、15天、19天)視神經(jīng)輔助性T細(xì)胞亞群Th1、Th2、Treg、Th17特異性細(xì)胞因子其轉(zhuǎn)錄因子的蛋

8、白及mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、ELISA檢測:小鼠視神經(jīng)內(nèi)IL-17蛋白含量在免疫后11天明顯增高(與對(duì)照組比較,p<0.05)；視神經(jīng)內(nèi)IFN-γ蛋白含量在免疫后19天增高明顯(與對(duì)照組比較,p<0.05)；視神經(jīng)內(nèi)IL-4蛋白含量在免疫后19天明顯下降(與對(duì)照組比較,p<0.05)。
　　 2、免疫組織檢測:小鼠視神經(jīng)FOXP3蛋白在免疫后11天表達(dá)明顯下降,持續(xù)至免疫后19天(與對(duì)照組比較,p

9、<0.05)。
　　 3、分子生物學(xué)檢測:小鼠視神經(jīng)IL-17與IFN-γ的mRNA表達(dá)及轉(zhuǎn)錄因子RORγt與T-beta mRNA的表達(dá)與其蛋白表達(dá)時(shí)點(diǎn)一致(與對(duì)照組比較,p<0.05),FOXP3mRNA的表達(dá)在免疫后11天出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄下降(與對(duì)照組比較,p<0.05),GATA3mRNA在免疫后19天下降明顯(與對(duì)照組比較,p<0.05)。
　　 第三部分，β-欖香烯對(duì)M OGEAE小鼠早期視神經(jīng)炎的神經(jīng)保護(hù)作用及干預(yù)

10、靶點(diǎn)
　　 目的：
　　 研究β-欖香烯對(duì)MOGEAE小鼠視神經(jīng)炎軸索損傷的神經(jīng)保護(hù)作用；明確β-欖香烯如何通過對(duì)輔助性T細(xì)胞亞群的分化調(diào)節(jié)及其特異性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用,為脫髓鞘性視神經(jīng)炎的治療提供新的方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 通過行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察β-欖香烯對(duì)EAE小鼠脫髓鞘性視神經(jīng)炎的神經(jīng)保護(hù)作用,進(jìn)一步通過分子生物學(xué)技術(shù)觀察β-欖香烯對(duì)輔助性T細(xì)胞

11、亞群特異性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄因子及調(diào)節(jié)因子的mRNA的表達(dá)影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、行為學(xué)改變:β-欖香烯能改善EAE小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分(與對(duì)照組比較,p<0.05)。
　　 2、組織形態(tài)學(xué)改變:β-欖香烯能減輕EAE小鼠軸索及髓鞘損傷。
　　 3、免疫組織化學(xué)改變:β-欖香烯可減少EAE小鼠β-APP蛋白表達(dá)及增加CNPase蛋白表達(dá)(與對(duì)照組比較,p<0.05),減輕軸索及髓鞘損傷。
　　

12、4、分子生物學(xué)改變:免疫后11天,β-欖香烯可減少EAE小鼠視神經(jīng)細(xì)胞因子IL-17、轉(zhuǎn)錄因子RORγt、分化調(diào)節(jié)因子IL-6、及IL-23p19的mRNA的表達(dá)(與對(duì)照組比較,p<0.05)；同時(shí)增加FOXP3、Socs3mRNA的表達(dá)(與對(duì)照組比較,p<0.05)。免疫后19天,β-欖香烯可減少EAE小鼠視神經(jīng)細(xì)胞因子IFN-γ、轉(zhuǎn)錄因子T-beta、分化調(diào)節(jié)因子IL-12p35的mRNA的表達(dá)(與對(duì)照組比較,p<0.05)；同時(shí)增

13、加GATA3mRNA的表達(dá),并維持FOXP3mRNA的較高水平表達(dá)(與對(duì)照組比較,p<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、MOG EAE小鼠模型早期視神經(jīng)可見軸索及髓鞘損傷,且軸索損傷并非完全繼發(fā)于脫髓鞘損傷。
　　 2、Th17亞群在脫髓鞘性視神經(jīng)炎的早期始動(dòng)了特異性的免疫應(yīng)答,Th1亞群在維持特異性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用,Treg亞群不僅在發(fā)病早期抑制異常的免疫應(yīng)答,而且在發(fā)病的高峰期同Th2亞群共同負(fù)