杜仲葉提取物誘導(dǎo)羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨及抑制成脂肪分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenehymal stem cells，MSCs）是骨髓中的非造血干細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能。在不同的條件下可以誘導(dǎo)分化為多個(gè)細(xì)胞系，包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等。傳統(tǒng)誘導(dǎo)劑只具有單純誘導(dǎo)成骨或成脂的分化作用，應(yīng)用較為局限。杜仲葉提取物作為一種誘導(dǎo)劑，具有提高骨密度、抑制骨吸收、調(diào)節(jié)骨代謝的藥效作用，可促

2、進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶分泌，同時(shí)抑制向脂肪細(xì)胞分化的作用。本實(shí)驗(yàn)探討杜仲葉提取物誘導(dǎo)羊MSCs向成骨細(xì)胞分化的同時(shí)，證實(shí)其具有抑制MSCs成脂肪分化的作用。 研究?jī)?nèi)容和方法： 1.采用全骨髓法體外分離培養(yǎng)羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD29、CD44和CD105進(jìn)行MSCs鑒定。 2.杜仲葉提取物對(duì)MSCs的增殖及成骨分化的影響。檢測(cè)ALP、鈣結(jié)節(jié)染色以觀察促進(jìn)成骨分化效應(yīng)。

3、 3.杜仲葉提取物抑制MSCs的成脂肪分化作用。行油紅-O染色以觀察抑制成脂肪分化效應(yīng)。 4.從細(xì)胞水平檢測(cè)杜仲葉提取物對(duì)MSCs成骨分化后細(xì)胞Cbfa ImRNA表達(dá)的影響，采用自動(dòng)凝膠成像分析儀進(jìn)行分析，觀察其促進(jìn)成骨分化效應(yīng)。 結(jié)果： 1.采用全骨髓培養(yǎng)法（即貼壁法）分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)換液和胰酶消化傳代后逐漸純化，方法簡(jiǎn)單實(shí)用。 2.與空白對(duì)照組比較，各成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶合成增多

4、，形成礦化結(jié)節(jié)，且傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)劑+杜仲葉提取物組、10-4、10-5g/mL杜仲葉提取物組誘導(dǎo)成骨情況優(yōu)于傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)劑組、10-6g/mL杜仲葉提取物組。 3.油紅O染色結(jié)果顯示，加入杜仲葉提取物的各成脂誘導(dǎo)組，其脂滴數(shù)量明顯少于傳統(tǒng)成脂誘導(dǎo)劑組和空白對(duì)照組，以10-4、10-5g/mL杜仲葉提取物組效果最佳。 4.RT-PCR顯示各成骨誘導(dǎo)組均能高效擴(kuò)增出171bp的Cbfa1mRNA基因轉(zhuǎn)錄片段，且10-4、10-

5、5g/mL濃度的杜仲葉提取物成骨細(xì)胞中Cbfa1mRNA表達(dá)水平差異無(wú)顯著性意義（P>0.05）。 結(jié)論： 1.杜仲葉提取物能誘導(dǎo)體外分離純化培養(yǎng)的羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化增殖，同時(shí)抑制其向脂肪細(xì)胞分化，實(shí)現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)作用。 2.杜仲葉提取物以10-4、10-5g/mL濃度的成骨及抑制成脂肪分化效果最佳。 3.10-4、10-5g/mL濃度的杜仲葉提取物可上調(diào)Cbfa1mRNA的表達(dá)，提示杜仲葉