黃芪多糖對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞微區(qū)力學(xué)性質(zhì)影響的研究.pdf

1、肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是多種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)病理過程。肝纖維化時(shí)肝臟內(nèi)部的力學(xué)環(huán)境會(huì)發(fā)生改變。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(Sinusoidalendothelial cells，SECS)作為肝臟的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，在力學(xué)環(huán)境改變中起重要作用。黃芪作為芪術(shù)顆粒的君藥之一，其具有補(bǔ)氣、行滯等功效，抗肝纖維化，我們研究其主要有效成分黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)對(duì)培養(yǎng)狀態(tài)下SEC

2、S的微區(qū)力學(xué)影響。利用實(shí)驗(yàn)室已建立的聯(lián)合成像和測(cè)量系統(tǒng)，進(jìn)行SECS的形貌及微區(qū)力學(xué)可視化觀測(cè)并測(cè)量，結(jié)合以血流、血液和血管為基礎(chǔ)研究對(duì)象的生物力藥理學(xué)理論，從力學(xué)角度探討黃芪抗肝纖維化的機(jī)制，從而為研究黃芪治療以SECS損傷為模型的肝纖維化的生物力藥理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究通過改變SECS的結(jié)構(gòu)與力學(xué)性質(zhì)最終得以逆轉(zhuǎn)肝纖維化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為名老中醫(yī)抗肝纖維理論內(nèi)涵提供科學(xué)依據(jù)。
　　 本研究共分為以下四個(gè)部分:
　

3、　 第一部分:SECS的原代培養(yǎng)及鑒定。
　　 目的:本研究以SECS作為研究對(duì)象，首先要實(shí)現(xiàn)對(duì)SECS的分離、純化和實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的培養(yǎng)，為進(jìn)一步的研究提供前提條件;同時(shí)利用免疫熒光法通過對(duì)SECS表面標(biāo)志物CD14及Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體的熒光染色，并利用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)來對(duì)分離純化后的SECS進(jìn)行鑒定并驗(yàn)證期純度。方法:在課題組前期分離培養(yǎng)的方法上進(jìn)行改進(jìn)，采用門靜脈插管法，將大鼠肝臟原位的用D-Hanks液沖

4、凈血液，再利用Ⅳ型膠原酶原位灌注，Ⅳ型膠原酶、DNA酶灌注離體消化，離心洗滌出肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行Percoll密度梯度離心法分離出SECS，選用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基原代培養(yǎng)SECS。將SECS經(jīng)CD14及Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體與一抗結(jié)合后，再與熒光二抗結(jié)合，并利用DAPI染細(xì)胞核，借助快速激光共聚焦熒光顯微鏡對(duì)SECS進(jìn)行熒光染色的鑒定。將SECS固定、脫水、干燥后在低真空模式下運(yùn)用環(huán)境掃描電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果:實(shí)現(xiàn)了對(duì)SECS的分離

5、和培養(yǎng)，部分細(xì)胞甚至實(shí)現(xiàn)了傳代。光學(xué)顯微鏡下觀察，SECS狀態(tài)良好，在體外培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞生長良好，形態(tài)典型，呈現(xiàn)出典型的從接種后的圓形向梭形的變形，并持續(xù)增殖。電子顯微鏡下觀察，細(xì)胞有典型的由成簇窗孔組成的篩板樣結(jié)構(gòu);同時(shí)觀察到，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，胞質(zhì)上的窗孔會(huì)減少和減小，隨著細(xì)胞的變形和向外鋪展，窗孔也從細(xì)胞核周圍向外遷移。免疫熒光法鑒定CD14鑒定的陽性率約達(dá)99％，Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體鑒定的陽性率約為2％。結(jié)論:本研究采用肝臟膠原

6、酶原位灌注、離體消化結(jié)合percoll密度梯度離心法成功實(shí)現(xiàn)了SECS的分離和純化，并篩選出一種適宜SECS的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基;通過觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及CD14及Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體熒光染色鑒定結(jié)果，證實(shí)了分離和培養(yǎng)SECS的成功，且SECS純度是較高的。
　　 第二部分:不同濃度的黃芪多糖對(duì)SECS楊氏模量的影響。
　　 目的:本研究以體外培養(yǎng)的SECS為研究對(duì)象，借助原子力顯微鏡(atomic forcemicros

7、cope，AFM)/快速激光共聚焦顯微鏡聯(lián)合成像及測(cè)量系統(tǒng)，運(yùn)用原子力顯微鏡力譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同濃度黃芪多糖作用后24小時(shí)的SECS楊氏模量的測(cè)量，探討SECS在不同濃度黃芪多糖干預(yù)后的微區(qū)力學(xué)響應(yīng)，以明確不同濃度的黃芪多糖對(duì)SECS力學(xué)性質(zhì)的影響。方法:研究分為空白組和實(shí)驗(yàn)組，其中空白組編號(hào)為1組:黃芪多糖0μg/ml，實(shí)驗(yàn)組依黃芪多糖的濃度分為5組:編號(hào)為2組:12.5μg/ml，3組:25μg/ml，4組:50μg/ml，5組:1

8、00μg/ml，6組:200μg/ml。依照實(shí)驗(yàn)分組，在接種后24小時(shí)的原代培養(yǎng)的SECS的培養(yǎng)基加入黃芪多糖溶液，并放置5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。借助原子力顯微鏡/快速激光共聚焦顯微鏡，以二氧化硅微球修飾的微懸臂為施力工具，對(duì)不同濃度黃芪多糖作用24小時(shí)后的SECS進(jìn)行楊氏模量的測(cè)量，將得到的力曲線通過相關(guān)軟件計(jì)算，利用SAS9.1軟件統(tǒng)計(jì)其壓人深度為300nm的楊氏模量。結(jié)果:各實(shí)驗(yàn)組均得到40個(gè)力曲線，共計(jì)240個(gè)力

9、曲線，統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組各組楊氏模量均比空白組大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，黃芪多糖濃度從12.5ug/ml至200ug/ml的5個(gè)組，SECS楊氏模量值呈波動(dòng)的上升趨勢(shì)，低濃度的12.5ug/ml組及25ug/ml組與高濃度的200ug/ml組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而中間濃度的50ug/ml組及100ug/ml組與低濃度及高濃度之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論:黃芪多糖作用24小時(shí)后，SECS的楊氏

10、模量增大，即黃芪多糖能使SECS變“硬”，并且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，且SECS的“硬度”與黃芪多糖的濃度呈正相關(guān)關(guān)系。SECS變“硬”后，可能會(huì)對(duì)肝竇內(nèi)血流阻力減小，從而對(duì)起到改善了肝臟的微循環(huán)的作用。
　　 第三部分:不同濃度的黃芪多糖對(duì)SECS鋪展及窗孔的影響。
　　 目的:本研究以體外培養(yǎng)的SECS為研究對(duì)象，利用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察不同濃度的黃芪多糖對(duì)作用后24小時(shí)后對(duì)SECS細(xì)胞鋪展及窗孔特點(diǎn)的影響，以明確不同濃

11、度的黃芪多糖作用24小時(shí)后對(duì)SECS生理結(jié)構(gòu)的影響。方法:同上，研究分為空白組和實(shí)驗(yàn)組，空白組編號(hào)為1組:黃芪多糖0μg/ml，其中實(shí)驗(yàn)組依黃芪多糖的濃度分為5組，編號(hào)為2組:12.5μg/ml，3組:25μg/ml，4組:50μg/ml，5組:100μg/ml，6組:200μg/ml。依照實(shí)驗(yàn)分組，在接種后24小時(shí)的原代培養(yǎng)的SECS的培養(yǎng)基加入黃芪多糖溶液，并放置5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。將經(jīng)黃芪多糖作用24小時(shí)后的S

12、ECS用戊二醛固定，然后使用乙醇濃度梯度脫水法脫水，再用臨界點(diǎn)干燥儀通過CO2臨界點(diǎn)干燥法進(jìn)行干燥。借助環(huán)境掃描電子顯微鏡在低真空模式下觀察并采集圖片。然后每組隨機(jī)選取十個(gè)細(xì)胞，利用圖片處理軟件進(jìn)行細(xì)胞面積及窗孔數(shù)據(jù)的采集，將采集的數(shù)據(jù)輸入Excel表中，并利用SAS9.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:觀察到黃芪多糖作用24小時(shí)后，SECS的鋪展面積呈波動(dòng)的上升趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組均比空白組細(xì)胞面積鋪展大，其中黃芪多糖25μg/ml組及200μg/m組與

13、空白組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。黃芪多糖作用SECS24小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組的窗孔均多于空白組，且實(shí)驗(yàn)組中隨著黃芪多糖濃度的升高，窗孔的數(shù)目呈上升趨勢(shì)，尤其是黃芪多糖較高濃度組100μg/ml組及200μg/ml組，窗孔數(shù)目均在空白組2倍以上。同時(shí)觀察到黃芪多糖能使細(xì)胞上單個(gè)窗孔面積有變小，且隨著黃芪多糖濃度的增加，單個(gè)窗孔面積有變小的趨勢(shì)，黃芪多糖中高濃度組25μg/ml組，50μg/ml組，100μg/ml組，200μg/ml組

14、與空白組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，低濃度組12.5μg/ml組與空白組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但是窗孔數(shù)目的增加對(duì)總窗孔面積的影響大于大于單個(gè)窗孔面積的減小，也就是說，黃芪多糖作用于SECS24小時(shí)后能使細(xì)胞總窗孔面積增大。結(jié)論:黃芪多糖作用24小時(shí)后有利于培養(yǎng)狀態(tài)下的SECS的鋪展:黃芪多糖作用24小時(shí)后窗孔有積極影響，且與黃芪多糖濃度呈正相關(guān)關(guān)系。間接的驗(yàn)證了黃芪增加培養(yǎng)狀態(tài)的SECS的總窗孔面積，改善肝

15、竇毛細(xì)血管化，方便了SECS兩側(cè)的物質(zhì)交流，從而起到抗肝纖維化作用。
　　 第四部分:黃芪多糖對(duì)SECS胞內(nèi)NO合成的影響。
　　 目的:一氧化氮(NO)是生物體內(nèi)重要的第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)血管有舒張作用。本研究以體外培養(yǎng)的SECS為研究對(duì)象，利用快速激光共聚焦熒光顯微鏡，NO熒光探針，觀察不同濃度的黃芪多糖對(duì)SECS合成NO的影響，以明確不同濃度的黃芪多糖對(duì)SECS生理功能的生物學(xué)影響。方法:首先，對(duì)培養(yǎng)狀態(tài)下的SE

16、CS進(jìn)行NO探針DAF-FM DA的安裝。以PBS溶液為空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組依照黃芪多糖濃度分為黃芪多糖25μg/ml組及黃芪多糖50μg/ml組，借助快速激光共聚焦熒光顯微鏡/全內(nèi)反射熒光顯微鏡聯(lián)合成像系統(tǒng)，對(duì)安裝了NO探針DAF-FM DA的SECS進(jìn)行實(shí)時(shí)的熒光監(jiān)測(cè)，按10秒/幀拍照，并在第500秒時(shí)加入PBS溶液或者黃芪多糖溶液，觀察實(shí)驗(yàn)區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度變化，并利用軟件以時(shí)間為橫坐標(biāo)、平均熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，將實(shí)驗(yàn)區(qū)域的平均熒光強(qiáng)

17、度變化繪制成曲線圖，以此判斷黃芪多糖對(duì)SECS合成NO的影響。結(jié)果:可以看出，空白組從實(shí)驗(yàn)開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束的1500s中，實(shí)驗(yàn)區(qū)域的熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，下降幅度為5％左右，第500s時(shí)加入PBS溶液未對(duì)整個(gè)變化趨勢(shì)產(chǎn)生影響。黃芪多糖25ug/ml組從實(shí)驗(yàn)開始到500S時(shí)，實(shí)驗(yàn)區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，在加入的黃芪多糖之后，平均熒光強(qiáng)度迅速上升，上升幅度約15％，然后隨著時(shí)間的延長平均熒光強(qiáng)度逐漸下降，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束的1500s時(shí)，熒光強(qiáng)度

18、基本恢復(fù)到加藥前水平。黃芪多糖50ug/ml同樣從實(shí)驗(yàn)開始到500 S時(shí)，實(shí)驗(yàn)區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，在加入黃芪多糖之后，平均熒光強(qiáng)度迅速上升，上升幅度約11％，然后隨著時(shí)間的延長平均熒光強(qiáng)度逐漸下降，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束的1500s時(shí)，熒光強(qiáng)度也基本恢復(fù)到加藥前水平。結(jié)論:NO探測(cè)DAF-FM DA在熒光照射下可能有一定的淬滅;黃芪多糖使體外培養(yǎng)狀態(tài)下的SECS內(nèi)NO合成量迅速增加。SECS的合成NO增加，能起到擴(kuò)張肝內(nèi)血管，從而起到改善