VHL---腎細(xì)胞癌腫瘤形成過(guò)程中HIF2α靶基因作用研究.pdf

1、研究目的:
　　約70％的腎透明細(xì)胞癌存在VHL等位基因的失活、表達(dá)缺失（表現(xiàn)為基因突變、缺失及啟動(dòng)子甲基化等），表明VHL基因突變(VHL-/-)在腎細(xì)胞癌的形成過(guò)程中具有重要的作用。VHL基因蛋白產(chǎn)物(pVHL)可與HIF結(jié)合，使HIF泛素化被蛋白水解酶降解。VHL-/-腎細(xì)胞癌細(xì)胞系786-O由于VHL的表達(dá)缺失而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)HIF-2α大量累積，后者可進(jìn)一步誘導(dǎo)百余種缺氧適應(yīng)基因(HIF-2α下游靶基因)的表達(dá)。本研究的目的

2、在于探討VHL-/-腎細(xì)胞癌腫瘤形成過(guò)程中HIF-2α下游靶基因的作用，尋找潛在的治療靶點(diǎn)，為腎細(xì)胞癌診斷、治療及預(yù)后提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.應(yīng)用半定量QPCR技術(shù)在mRNA水平驗(yàn)證在786-O細(xì)胞(786-O VHL+/+，786-O VHL-/-,786-O HIF2α depleted[VHL-/-HIF566],786-O HIF2α depleted[VHL-/-HIF1631], VHL+/+ H

3、IF2α-dPA[active], VHL+/+ HIF2α-PA-dTA[inactive])由單一的有活性的HIF-2α誘導(dǎo)表達(dá)升高的基因;
　　2.應(yīng)用RNAi技術(shù)，慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默特定HIF下游靶基因;
　　3.對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染相應(yīng)shRNA的細(xì)胞進(jìn)行Western Blot，Real Time RCR或者Elisa驗(yàn)證其是否成功抑制該基因的表達(dá);
　　4.體外增殖實(shí)驗(yàn)及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，研究特定HIF2α下

4、游靶基因?qū)HL-/-腎細(xì)胞癌腫瘤形成的作用。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)HIF對(duì)VHL-/-的腎細(xì)胞癌成瘤十分重要。
　　2.在786-O細(xì)胞中，HIF轉(zhuǎn)錄活性緊密調(diào)控著VEGF，CCND1，ENO2，EglN3，ANGPTL4, Glut-1, IGFBP3, HIG2, CA12, MTUS1, ZNF395, CP, MXI-1,ARRDC3，Serpine1，Apol1，DDIT4，DUSP1等基

5、因的表達(dá)。
　　3.抑制VEGF，CCND1的表達(dá)可以抑制VHL-/-腎細(xì)胞癌生長(zhǎng)，提示它們是促癌基因;抑制ANGPTL4，EGLN3或ENO2的表達(dá)并不影響VHL-/-腎細(xì)胞癌生長(zhǎng);GLUT1或IGFBP3表達(dá)缺失明顯促進(jìn)VHL-/-腎細(xì)胞癌生長(zhǎng)，提示它們有一定的抑瘤作用。
　　4.抑制IGF1R蛋白表達(dá)導(dǎo)致IGFBP3在mRNA和蛋白水平表達(dá)的顯著增加，并抑制腫瘤生長(zhǎng)，提示IGF1R是潛在的腎細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)。
　　

6、結(jié)論:
　　1.HIF-2α對(duì)VHL-/-腎細(xì)胞癌成瘤至關(guān)重要，但HIF下游靶基因的表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用則可表現(xiàn)為促進(jìn)、抑制亦或沒(méi)有影響;通過(guò)對(duì)HIF-2α下游靶基因的研究可以發(fā)現(xiàn)潛在的VHL-/-腎細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)或診斷及預(yù)后指標(biāo)。
　　2.沉默IGF1R能夠抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞系786-O成瘤，提示IGF1R是潛在的腎細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)，其作用的發(fā)揮可能通過(guò)上調(diào)IGFBP-3而實(shí)現(xiàn)，為進(jìn)一步明確VHL-HIF-HRGs調(diào)節(jié)腫瘤