國(guó)產(chǎn)吲哚菁綠前囊膜染色對(duì)兔角膜內(nèi)皮活性的影響.pdf

1、目的：研究不同濃度與不同時(shí)間條件下國(guó)產(chǎn)吲哚菁綠前囊膜染色劑對(duì)活體兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響。 方法：選擇健康科研用兔18只（36眼），無眼疾，體重2．8～3．0kg，雌雄不拘。由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。隨機(jī)分為4組，即分別為A組2．5毫克／毫升、B組5毫克／毫升、C組7．5毫克／毫升的國(guó)產(chǎn)吲哚菁綠溶液組，D組為平衡鹽液對(duì)照組。其中A、B、C三組溶液配制方法為分別將12．5毫克、25毫克、37．5毫克的國(guó)產(chǎn)吲哚菁綠凍干粉末溶解

2、于0．5毫升滅菌注射用水中，將該混合溶液搖晃均勻約5分鐘，待溶液均勻綠色無可見顆粒后，分別加入4．5毫升平衡鹽液稀釋吲哚菁綠溶液濃度即得到2．5毫克／毫升、5毫克／毫升、7．5毫克／毫升的國(guó)產(chǎn)吲哚菁綠溶液。D組為按照注射用水與平衡鹽液比例1：9配置與試驗(yàn)組吲哚菁綠溶液相同滲透壓的平衡鹽液做對(duì)照液組，四組溶液滲透壓經(jīng)測(cè)定接近于房水滲透壓。每組9眼，每組分3亞組分別給予上述溶液作用30秒、60秒、90秒。 動(dòng)物模型具體制備方法為各組

3、兔全身麻醉后，將其俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，開瞼器開瞼，固定眼球。選擇角鞏膜緣位置，前房穿刺刀在顳上方角鞏膜緣穿刺前房，再用27號(hào)鈍針頭經(jīng)角鞏膜緣緊貼前囊中央依據(jù)各組要求注入約0．3毫升新鮮配制的不同濃度吲哚菁綠溶液或?qū)φ找浩胶恹}液，操作過程中注意保護(hù)角膜內(nèi)皮。待指定時(shí)間30秒、60秒、90秒后，做輔助側(cè)切口，前房立即注入粘彈劑玻璃酸鈉維持前房、保護(hù)角膜內(nèi)皮細(xì)胞，沿兔眼角膜緣用顯微剪小心取下角膜。將取下的角膜用包裹液立在載玻片上，迅速移入-2

4、0℃AO低溫恒冷切片箱，待速冷成型后，每只角膜在中央?yún)^(qū)切成8μm的角膜冰凍切片6張，放入新鮮配置的NADH，LDH孵育液各2張進(jìn)行孵育，另外2張切片分別作對(duì)照投入未加底物的2種酶孵育液內(nèi)，保溫箱中37℃孵育30分鐘。乳酸脫氫酶（LDH）與還原型輔酶Ⅰ（NADH）二種酶存在于組織細(xì)胞內(nèi)，利用酶的組織化學(xué)染色方法測(cè)定組織細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）與還原型輔酶Ⅰ（NADH）的酶活性改變。剩余部分角膜投入10%福爾馬林溶液固定，按常規(guī)脫水、石蠟

5、包埋、切片、HE染色步驟制作組織學(xué)切片，厚度為5μm，顯微鏡下觀察。數(shù)據(jù)的處理可取各個(gè)不同處理組4張酶活性染色的切片，顯微固像分析儀下隨機(jī)取酶反應(yīng)帶上6點(diǎn)，測(cè)定LDH、NADH二組酶存在，酶活性以平均累積光密度值表示，采用SPSS11．0軟件進(jìn)行方差分析，并比較不同濃度國(guó)產(chǎn)吲哚菁綠溶液組內(nèi)3個(gè)時(shí)間段與對(duì)照組3個(gè)時(shí)間段之間兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞酶活性的差異，P<0．05則差異具有顯著性意義。在有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義實(shí)驗(yàn)組內(nèi)進(jìn)行酶活性與時(shí)間關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、分析。 結(jié)果：LDH、NADH活性在A組、B組與D組比較差異均無顯著性意義（P>0．05），而C組在30s、60s、90s LDH光密度值分別為186．12±12．12A、169．97±11．14A、161．82±17．91A，NADH光密度值分別為178．86±12．67A、165．39±18．79A、158．81±17．48A，LDH、NADH活性在C組與A組、B組、D組比較差異均有顯著性意義（P<0．05）。C組組內(nèi)，酶的

7、活性與藥物接觸角膜時(shí)間呈線性關(guān)系，負(fù)相關(guān)r=-0．45。（P<0．05）。 結(jié)論：本研究結(jié)果顯示0．75%國(guó)產(chǎn)吲哚菁綠溶液在90秒內(nèi)即可對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，并且毒性大小取決于該濃度下的作用時(shí)間，時(shí)間長(zhǎng)則毒性作用加強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。0．25%與0．5%的國(guó)產(chǎn)吲哚菁綠溶液在90秒內(nèi)對(duì)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞無毒性。因此，在眼外科手術(shù)中使用0．25%與0．5%的國(guó)產(chǎn)吲哚菁綠染色劑在90秒內(nèi)染色眼內(nèi)組織時(shí)，可能不影響人角膜內(nèi)皮細(xì)胞活