MYH9相關(guān)疾病的臨床和分子致病機(jī)理研究.pdf

1、MYH9相關(guān)疾?。∕YH9-related disease，MYH9-RD）是一種常染色體顯性遺傳性疾病，是由位于人染色體22q12.3的非肌性肌球蛋白重鏈9基因(MYH9)突變導(dǎo)致。MYH9基因編碼非肌性肌球蛋白重鏈 IIA(NMMHC-IIA)，分子量約220 kDa，在細(xì)胞遷移、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞粘附、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞極性形成和細(xì)胞趨向性等多項(xiàng)功能中均起著重要的作用。至今為止，對(duì)于MYH-RD的發(fā)病機(jī)制和NMMHC-IIA的正常功能尚未

2、解釋清楚。因此，本研究對(duì)17例MYH9-RD病人進(jìn)行了臨床特征和基因分析，同時(shí)進(jìn)行了基因突變對(duì)于細(xì)胞形態(tài)的影響、NMMHC-IIA相互作用蛋白的鑒定、NMMHC-IIA突變后對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的影響等研究。這些研究對(duì)于深入闡述NMMHC-IIA的功能和MYH9-RD的分子致病機(jī)制具有重要的意義。
　　目的：
　　1、分析17例MYH9-RD患者臨床特征，進(jìn)行MYH9基因診斷；2、構(gòu)建5種不同NMMHC-IIA突變（K74E、D

3、1424N、W33R、E1841K和R702H-IIA）的pEGFP-C3-IIA表達(dá)載體，篩選HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，觀察包涵體和細(xì)胞形態(tài)的變化；3、鑒定NMMHC-IIA相互作用蛋白；4、分析NMMHC-IIA突變后對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的影響。
　　方法：
　　1、用全血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及手工法進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)；用瑞氏染色法和免疫熒光法觀察血小板形態(tài)及中性粒細(xì)胞包涵體；抽提患者外周血基因組DNA，PCR擴(kuò)增MYH9患者的40個(gè)外顯子

4、及兩端側(cè)翼序列，DNA測(cè)序并與基因序列比對(duì)以確定基因異常；用限制性核酸內(nèi)切酶電泳法分析排除多態(tài)性。
　　2、構(gòu)建正常的pEGFP-C3-NMMHC-IIA表達(dá)載體，利用PCR介導(dǎo)的質(zhì)粒定點(diǎn)突變技術(shù)，以K74E、D1424N、W33R、E1841K和R702H突變引物進(jìn)行擴(kuò)增，Dpn I消化后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，測(cè)序正確后擴(kuò)大培養(yǎng)，無(wú)菌環(huán)境下提取高質(zhì)量高濃度質(zhì)粒；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（Lipofectamine200

5、0）轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，加G418進(jìn)行篩選，得到HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；利用免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)NMMHC-IIA包涵體形成情況。
　　3、應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法高通量鑒定非肌性肌球蛋白IIA相互作用蛋白組成；應(yīng)用生物信息學(xué)軟件Gominer分析非肌性肌球蛋白IIA相互作用蛋白的分子功能、亞細(xì)胞定位及生物過(guò)程等。
　　4、應(yīng)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)（SILAC）定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分

6、析突變型非肌性肌球蛋白IIA對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的影響；應(yīng)用生物信息學(xué)軟件Gominer分析表達(dá)受到影響蛋白的分子功能分布情況；采用蛋白免疫印跡技術(shù)驗(yàn)證上述分析得到的表達(dá)發(fā)生變化的蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1、17例患者除3例外，都有血小板計(jì)數(shù)下降、血小板體積增大、中性粒細(xì)胞內(nèi)淡藍(lán)色包涵體三聯(lián)征；瑞氏染色沒(méi)有觀察到包涵體的3例病人，經(jīng)過(guò)免疫熒光分析，都在胞漿中觀察到了小的顆粒狀的包涵體；基因分析共發(fā)現(xiàn)了9種突變， W33R、p

7、.Q1443_K1445dup、K74E、D1447A、IVS25+1T→A、3個(gè)R702H、6個(gè)D1424N、2個(gè)R1933X、E1945X，其中前5種突變是首次發(fā)現(xiàn)的新突變。
　　2、成功構(gòu)建了K74E、D1424N、W33R、E1841K和R702H-IIA的pEGFP-C3-IIA突變質(zhì)粒表達(dá)載體；得到了轉(zhuǎn)染wt、K74E、D1424N、W33R、E1841K和R702H-IIA的HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；除了R702H外，

8、其它表達(dá)突變型非肌性肌球蛋白IIA的HEK293細(xì)胞中都有包涵體形成，且各種突變型細(xì)胞骨架形態(tài)變化都不同。
　　3、在蛋白質(zhì)組學(xué)水平分析了非肌性肌球蛋白IIA相互作用蛋白的組成，共計(jì)鑒定到4591個(gè)肽段，其對(duì)應(yīng)151個(gè)蛋白，這些蛋白在分子功能、亞細(xì)胞定位以及生物過(guò)程等方面具有非常廣泛的分布。
　　4、大規(guī)模比較了表達(dá)突變型非肌性肌球蛋白 IIA細(xì)胞中的蛋白表達(dá)譜與表達(dá)野生型非肌性肌球蛋白IIA細(xì)胞的蛋白表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者與

9、后者相比有55個(gè)蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，有37個(gè)蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)。這92個(gè)表達(dá)明顯變化的蛋白具有廣泛的功能分布；其中熱休克蛋白70（HSP70）、非極性肌球蛋白IIB的蛋白免疫印跡表達(dá)情況與上述大規(guī)模定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析結(jié)果是一致的。
　　結(jié)論：
　　1、確證17例MYH9-RD病人，發(fā)現(xiàn)了9種突變，其中W33R、p.Q1443_K1445dup、K74E、D1447A、IVS25+1T→A為國(guó)際上首次報(bào)道。
　　2、