辛伐他汀對COPD氣道炎癥和細胞凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、[目的]
　　 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一個日益嚴重的全球健康問題，臨床實驗表明，他汀類藥物能減少COPD患者的發(fā)病率和病死率。本研究用辛伐他汀對COPD大鼠進行干預，從大鼠的一般狀況、肺組織病理變化等多個方面評價其作用；通過對支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清中主要炎性因子白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應蛋白(CRP

2、)的測定，探討辛伐他汀在慢性阻塞性肺疾病治療中的抗炎作用機制；通過測定肺組織凋亡細胞的數目及調亡相關因子(Caspase-3、eNOS、iNOS)蛋白和基因的表達，探討辛伐他汀對COPD大鼠肺組織細胞凋亡的影響及作用機制。本課題研究為慢性阻塞性肺疾病的臨床治療提供新的藥物選擇。
　　 [方法]
　　 1.采用熏香煙加氣管內滴入脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)法建立大鼠COPD模型，將75只雄性Wi

3、star大鼠隨機分為正常對照組、COPD模型組和辛伐他汀治療組，治療組在造模兩周后給予辛伐他汀2.5mg/kg灌胃治療，每天1次，治療6周。
　　 2.觀察正常對照組、COPD模型組和辛伐他汀治療組大鼠的一般情況、體質量增長率，肺組織的病理改變(HE染色)，使用天狼星猩紅染色及三聯染色觀察大鼠肺組織膠原情況。
　　 3.支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞計數和分類。
　　 4.使用酶聯免疫法(ELISA)分別測定B

4、ALF中白介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平，血清中IL-8、TNF-α、C反應蛋白(CRP)的水平。
　　 5.采用免疫組化方法(SABC法)測定肺組織中IL-8、TNF-α炎性細胞因子的表達。
　　 6.采用原位末端標記技術(TUNEL法)檢測肺組織凋亡細胞。
　　 7.用免疫組化(SABC法)的方法檢測肺組織中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、內皮型一氧化氮合

5、酶(eNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表達。
　　 8.用RT-PCR的方法檢測肺組織中Caspase-3、eNOS、iNOS mRNA的表達。
　　 [結果]
　　 1.一般情況及體質量增長率
　　 觀察各組大鼠的被毛、活動性、飲食、咳嗽等一般情況及體質量增長率，與模型組比較，治療組一般情況有所改善，體質量增長率顯著提高(P<0.01)。
　　 2.各組大鼠肺組織病理學變化

6、　　 正常對照組可見氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞完整，纖毛排列整齊，氣管及各級支氣管見少量杯狀細胞，氣道結構未見異常，周圍血管壁未見炎癥細胞浸潤，肺泡大小正常，結構完整。
　　 模型組可見肺氣腫形成，氣管、支氣管黏膜上皮纖毛倒伏，部分上皮脫落，杯狀細胞增生，粘膜下層及肌層大量炎癥細胞浸潤，部分腺泡萎縮，血管周圍較多炎癥細胞浸潤，毛細血管充血，肺泡結構不完整，肺泡壁變薄、斷裂，肺泡間隔可見大量炎癥細胞浸潤。
　　 辛伐他汀治

7、療組可見肺氣腫形成，但氣道上皮細胞脫落、杯狀細胞增多、氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤等方面較模型組均有不同程度減輕。
　　 3.天狼星猩紅染色觀察各組大鼠肺組織膠原情況
　　 模型組及治療組大鼠支氣管壁黃紅色的Ⅰ型膠原較正常組顯著增多，主要沉積在氣道壁。伴行的肺小動脈壁Ⅰ型膠原亦明顯增多，平滑肌顯著增厚，管腔縮小。圖像定量分析顯示：與正常組相比，模型組及治療組Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維IOD值升高(P<0.01)；與模型組比較，治療組

8、Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維IOD值明顯降低(P<0.01)。與正常組相比，模型組及治療組Ⅰ/Ⅲ型膠原的面積比例顯著上升(P<0.01)。與模型組相比，治療組Ⅰ/Ⅲ型膠原的面積比例顯著下降(P<0.01)。
　　 4.三聯染色觀察各組大鼠肺組織膠原
　　 與正常對照組相比，模型組及治療組小氣道及中等氣道壁紅染膠原沉積顯著增多(P<0.01)，氣道固有膜膠原與高聳的上皮皺褶一起凸入管腔，外膜膠原延伸至周圍肺間質。治療組小氣道及中等氣道

9、壁膠原沉積較模型組顯著減輕(P<0.01)。與正常對照組相比，模型組和治療組肺平均內襯間隔(Mean linear intercept，MLI)增大(P<0.01)，平均肺泡數(Mean alveolar numbers，MAN)減少(P<0.01)；與模型組相比，治療組MLI減小(P<0.01)，MAN增多(P<0.01)。
　　 5.各組大鼠BALF中細胞總數和分類
　　 細胞總數、中性粒細胞比例、單核-巨噬細胞比例

10、、淋巴細胞比例在三組間的差異具有統計學意義(P<0.01)；與正常對照組比較，模型組和治療組中細胞總數和中性粒細胞比例均升高(P<0.01)；與模型組比較，治療組細胞總數和中性粒細胞比例顯著下降(P<0.01)。
　　 6.各組大鼠BALF中IL-8、TNF-α的濃度
　　 IL-8、TNF-α的濃度在三組間的差異具有統計學意義(P<0.01)；與正常對照組比較，模型組及治療組BALF中的IL-8、TNF-α水平均顯著升

11、高(P<0.01)；與模型組比較，治療組中IL-8、TNF-α濃度均降低(P<0.01)。
　　 7.各組大鼠血清中IL-8、TNF-α、CRP的濃度
　　 IL-8、TNF-α、CRP濃度在三組間的差異具有統計學意義(P<0.01)；與正常對照組比較，模型組及治療組IL-8、TNF-α、CRP濃度均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，治療組IL-8、TNF-α、CRP濃度均降低(P<0.05)。
　　 8.

12、各組BALF中性粒細胞比例和IL-8濃度之間的相關性分析
　　 正常對照組BALF中性粒細胞比例和IL-8濃度的無相關性關系(r=0.043，P>0.05)，COPD模型組BALF中性粒細胞比例和IL-8濃度有顯著正相關(r=0.757，P<0.01，相關方程為y=0.654x+13.996)，辛伐他汀治療組BALF中性粒細胞比例和IL-8濃度有顯著正相關(r=0.592，P<0.01，相關方程為y=0.547x+14.261)

13、。
　　 9.各組BALF中性粒細胞比例和TNF-α濃度之間的相關性分析
　　 正常對照組BALF中性粒細胞比例和TNF-α濃度的無相關性關系(r=0.062，P>0.05)，COPD模型組BALF中性粒細胞比例和TNF-α濃度有無相關性關系(r=0.139，P>0.05)，辛伐他汀治療組BALF中性粒細胞比例和TNF-α濃度無相關性關系(r=0.202，P>0.05)。
　　 10.各組大鼠肺組織中IL-8、T

14、NF-α的表達
　　 與正常對照組相比，模型組及治療組表達增多(P<0.05)，治療組與模型組相比，IL-8的表達減少(P<0.05)；TNF-α主要表達于肺泡巨噬細胞、支氣管上皮細胞、血管內皮細胞等，與正常對照組相比，模型組及治療組表達增多(P<0.05)，治療組與模型組相比，TNF-α的表達減少(P<0.05)。
　　 11.各組大鼠肺組織細胞凋亡
　　 與正常對照組相比，模型組和治療組氣道上皮細胞及肺泡上皮

15、細胞凋亡增加(P<0.01)；治療組與模型組相比肺泡上皮細胞和氣道上皮細胞凋亡減少(P<0.01)。
　　 12.各組大鼠肺組織中凋亡相關因子(caspase-3，iNOS，eNOS)mRNA的表達
　　 與正常對照組大鼠肺組織相比，模型組及治療組Caspase-3及iNOS mRNA表達增多(P<0.01)，與模型組大鼠肺組織相比，治療組Caspase-3及iNOS mRNA表達減少(P<0.01)；與正常對照組大鼠肺

16、組織相比，模型組及治療組eNOS mRNA表達減少(P<0.01)，與模型組大鼠肺組織相比，治療組eNOS mRNA表達增多(P<0.01)。
　　 13.各組大鼠肺組織中凋亡相關因子(caspase-3，iNOS，eNOS)的表達
　　 Caspase-3主要表達于氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管和氣道平滑肌細胞，與正常組對照相比，模型組及治療組表達增多(P<0.01)，治療組與模型組相比，Caspase-3的表達減少

17、(P<0.01)；eNOS的表達主要分布于血管內皮細胞和氣道上皮細胞，與正常對照組相比，模型組及治療組eNOS的表達減少(P<0.01)，與模型組相比，治療組eNOS表達增多(P<0.01)；iNOS的表達主要分布于氣道上皮細胞、巨噬細胞以及氣道和血管的平滑肌細胞，與正常對照組相比，模型組和治療組iNOS表達增多(P<0.05)，治療組與模型組相比，iNOS表達減少(P<0.01)。
　　 14.凋亡相關因子(caspase-3

18、，iNOS，eNOS)的相關性分析
　　 正常對照組、模型組及治療組大鼠Caspase-3、iNOS、eNOS基因表達及蛋白表達呈Caspase-3與iNOS正相關，與eNOS負相關。
　　 [結論]
　　 1.COPD模型大鼠中肺組織炎癥反應及肺組織膠原沉積增加，肺泡上皮及氣道上皮細胞凋亡增加，Caspase-3、iNOS的基因及蛋白表達增加，eNOS相應減少，三者存在相關性。
　　 2.辛伐他汀可以改

19、善COPD大鼠的一般狀況，提高體質量增長率，減輕支氣管及肺血管周圍炎細胞浸潤及肺組織內膠原沉積。辛伐他汀可能對COPD大鼠有一定療效，有望為COPD的治療提供新的藥物選擇。
　　 3.辛伐他汀可以通過抑制肺組織、BALF及血清中炎性因子(IL-8、TNF-α、CRP)的表達，減輕COPD大鼠肺組織炎性反應。
　　 4.辛伐他汀可以通過增加eNOS和抑制iNOS蛋白及基因的表達，進而減少促調亡因子Caspase-3的表達，