法呢基硫代水楊酸對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥,氣道重塑和Th細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景:支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病，其病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚，涉及到免疫學(xué)、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)、遺傳、環(huán)境等多種因素。氣道炎癥，氣道高反應(yīng)性，氣道重塑是其三個(gè)基本特征。目前有關(guān)Ras通路與哮喘的關(guān)系的研究逐漸成為熱點(diǎn)。Ras作為細(xì)胞生長(zhǎng)分化的主要調(diào)節(jié)者，在細(xì)胞外刺激產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中處于中樞地位。已有研究顯示Ras介導(dǎo)的各下游信號(hào)傳導(dǎo)通路在支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)中均發(fā)揮重要作用。研究Ras信

2、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有助于尋求新的藥物作用靶點(diǎn)。
　　 Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路主要由以下幾條途徑組成:1.絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)。Ras-MAPK通路是目前最為明確的信號(hào)通路。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal regulated kinaseERK)是MAPK信號(hào)通路下游家族成員之一，參與調(diào)控細(xì)胞有絲分裂，與細(xì)胞的增殖分化遷移密切

3、相關(guān)。2.磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信號(hào)通路(Phosphatidylinositol-3-kinase(PI3K)-protein kinase B(AKT))。在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、凋亡、增殖和分化方面與Ras-MAPK途徑同等重要。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起重要的輔助作用，介導(dǎo)氣道炎性疾病嗜酸細(xì)胞的分化、降解、聚集及粘附分子的表達(dá)。3.GalGEF信號(hào)通路。使細(xì)胞免于凋亡，并加速細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長(zhǎng)。4.其他。如Rac和Rho信號(hào)通路、

4、Ras鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(RasGRP)信號(hào)通路、NF-kappB信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)信號(hào)通路等。
　　 Ras傳導(dǎo)通路與很多疾病（包括支氣管哮喘、腫瘤等）的發(fā)生發(fā)展均有密切的關(guān)系。已經(jīng)證實(shí):基于ras信號(hào)通路為靶標(biāo)的抗腫瘤治療方法，在治療由ras突變所導(dǎo)致的腫瘤中具有重要的價(jià)值。目前針對(duì)Ras信號(hào)途徑的藥物研究主要有以下幾類(lèi):(1)法尼基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑(Farnesyltransferase inhibi

5、tors，F(xiàn)TIs)。法呢基轉(zhuǎn)移酶(Farnesyltransferase，F(xiàn)Tlase)是Ras蛋白加工過(guò)程中最重要的催化酶之一。Ras蛋白翻譯后的修飾過(guò)程主要包括三個(gè)步驟:Ras蛋白羧基末端半胱氨酸(Cys)殘基的法呢酯化，經(jīng)法呢酯化的Cys殘基的甲基化，以及清除羧基末端的氨基酸殘基。其中羧基端的法尼基化是ras蛋白定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)進(jìn)而發(fā)揮效能的關(guān)鍵修飾步驟。因此，抑制ras蛋白翻譯后羧基端的法尼基化是抑制ras信號(hào)通路的一種重要治

6、療手段。(2)抗Ras的反義寡核苷酸。根據(jù)Ras蛋白和mRNA序列設(shè)計(jì)反義RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式，抑制、破壞目的基因，以下調(diào)Ras的表達(dá)。(3)抑制ras的下游靶點(diǎn)。通過(guò)反義核苷酸技術(shù)合成的小分子化合物能特異抑制Ras及下游靶點(diǎn)RafmRNA的表達(dá)，下調(diào)ERK活性。(4)抑制Ras的上游靶點(diǎn)。Ras蛋白上游信號(hào)通路的異?；罨嗫杉せ頡as。小分子酪氨酸激酶抑制劑和針對(duì)細(xì)胞外受體區(qū)域的抗體，通過(guò)阻斷生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的活性，從

7、而抑制Ras的活化。(5)恢復(fù)Ras蛋白GTP酶的活性。Ras突變導(dǎo)致GTP酶失活，已研制的GTP類(lèi)似物可代替GAP，更有效的水解Ras蛋白。(6)其他。包括以Ras通路為靶標(biāo)的基因治療、免疫治療，以及以Ras外周成分為靶標(biāo)的或以與Ras信號(hào)通路明顯相關(guān)的其他信號(hào)通路為靶標(biāo)的治療方法等。目前，基于ras信號(hào)通路為靶標(biāo)的治療策略，在人類(lèi)腫瘤的治療中顯示了廣闊的前景。
　　 但Ras抑制劑對(duì)支氣管哮喘的干預(yù)作用及其機(jī)制尚罕見(jiàn)報(bào)道。反

8、式法呢基硫代水楊酸(Trans-farnesyl thiosalicylic acid，F(xiàn)TS)是一種新型的Ras抑制劑，F(xiàn)TS對(duì)結(jié)合活化GTP的Ras具有明顯的選擇性，在動(dòng)物模型中無(wú)明顯毒性或不良副作用。
　　 目的:本研究建立小鼠哮喘模型，著重研究FTS對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥，氣道重塑和Th細(xì)胞分化的影響，進(jìn)一步探討Ras通路與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以及FTS作為Ras抑制劑，對(duì)支氣管哮喘的干預(yù)機(jī)制，為哮喘的治療提供新的思路

9、。
　　 方法:6-8周級(jí)BALB/c小鼠60只，隨機(jī)法分成六組，每組10只。正常對(duì)照組、哮喘模型組、地塞米松治療組、5FTS干預(yù)組(5mg/kg)、10FTS干預(yù)組10mg/kg)、15FTS干預(yù)組(15mg/kg)。
　　 1.制作哮喘小鼠模型:于實(shí)驗(yàn)第1d、第14 d致敏，即卵白蛋白(OVA)40μg由1mg氫氧化鋁乳化，總體積200μl，腹腔注射。第21-27d，將小鼠置于密閉容器內(nèi)，以超聲霧化器霧化，3％OVA

10、鹽水氣溶膠吸入激發(fā)，每天1次，每次30min。
　　 2.藥物干預(yù):地塞米松治療組，于每次激發(fā)前1小時(shí)腹腔注射2mg/kg地塞米松;FTS干預(yù)組，于每次激發(fā)前1小時(shí)分別腹腔注射5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg FTS。
　　 3.收集實(shí)驗(yàn)標(biāo)本:支氣管肺泡灌洗液，血清，肺組織、脾組織。
　　 4.檢測(cè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)
　　 4.1小鼠左肺組織HE染色，觀察組織形態(tài)學(xué)變化。
　　 4.2檢測(cè)小鼠支

11、氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞數(shù)。
　　 4.3酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠血清中IL-5濃度。
　　 4.4免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)小鼠右肺組織pan-ras，ERK蛋白表達(dá)水平，脾組織GATA-3蛋白表達(dá)水平。
　　 4.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Quantitative PCR，QPCR):檢測(cè)小鼠右肺組織MMP-2、MMP-9mRNA表達(dá)，脾組織Foxp3

12、，GATA-3mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1)肺組織形態(tài)學(xué):正常對(duì)照組小鼠可見(jiàn)支氣管壁光滑，上皮細(xì)胞完整，肺泡及支氣管周?chē)匆?jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡黏膜無(wú)腫脹。哮喘模型組小鼠，肺泡及支氣管周?chē)?jiàn)可見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管上皮水腫，氣道周?chē)⊙艹溲黠@。地塞米松及FTS干預(yù)組，可見(jiàn)支氣管及肺泡周?chē)倭垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，炎癥及充血不同程度的減輕。
　　 2)小鼠支氣管肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞計(jì)

13、數(shù)、血清IL-5濃度在各組間均有顯著性差異（BALF細(xì)胞總數(shù)F=52.27，嗜酸細(xì)胞數(shù)F=67.61，血清IL-5濃度F=23.57，P值均為0.00）。哮喘組小鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸細(xì)胞數(shù)及血清IL-5濃度均較正常組增高(P＜0.05)，地塞米松及FTS干預(yù)組各指標(biāo)均低于未干預(yù)組(P＜0.05)，且隨著FTS濃度的增加，各指標(biāo)下降更明顯。10FTS及15FTS組與地塞米松組相比，有更顯著地療效。但10FTS組與15FTS組

14、間差異無(wú)顯著性。
　　 3)小鼠肺pan-ras蛋白的表達(dá)均值在各組間有顯著性差異(F=153.55，P=0.00)。哮喘組小鼠肺組織中pan-Ras的蛋白表達(dá)均較正常對(duì)照組增高(P＜0.05)，地塞米松及FTS干預(yù)組較未干預(yù)組表達(dá)減少(P＜0.05)，與地塞米松治療組相比，F(xiàn)TS的下調(diào)作用更為明顯，但無(wú)濃度依賴(lài)性。
　　 4)小鼠脾GATA-3蛋白及GATA-3mRNA的表達(dá)均值在各組間均有顯著性差異（GATA-3蛋白

15、F=106.44，P=0.00;GATA-3mRNA F=6.02，P=0.00）。哮喘組脾組織GATA-3mRNA和GATA-3蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組均有增加(P＜0.05)，地塞米松及FTS干預(yù)組較未干預(yù)組表達(dá)減少(P＜0.05)，減少程度與FTS濃度無(wú)關(guān)。對(duì)GATA-3mRNA的表達(dá)，F(xiàn)TS各組療效與地塞米松相當(dāng)。對(duì)GATA-3蛋白表達(dá)，地塞米松組和FTS各相比差異顯著(P＜0.05)，提示FTS對(duì)脾GATA-3蛋白表達(dá)的抑制作用

16、大于地塞米松組。
　　 5)小鼠脾Foxp3mRNA的表達(dá)均值在各組間有顯著性差異(F=2.85，P=0.029)。哮喘組小鼠脾組織中Foxp3mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組減少(P＜0.05)。FTS干預(yù)后，表達(dá)水平較未干預(yù)組增高(P＜0.05)，且與濃度無(wú)關(guān)。地塞米松干預(yù)后雖有升高趨勢(shì)，但與未干預(yù)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 6)小鼠肺ERK1/2蛋白的表達(dá)均值在各組間有顯著性差異(F=92.34，P=0.0

17、0)。哮喘組小鼠肺組織ERK1/2的蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組增高(P＜0.05)，干預(yù)后，表達(dá)水平較未干預(yù)組減少(P＜0.05)，減少程度與FTS濃度無(wú)關(guān)。地塞米松組與FTS組各相比差異顯著(P＜0.05)，提示FTS的作用強(qiáng)于地塞米松。
　　 7)小鼠肺MMP-2、MMP-9mRNA的表達(dá)均值在各組間有顯著性差異（MMP-2F=4.51，P=0.003;MMP-9F=4.68，P=0.002）。哮喘小鼠肺組織MMP-2、MMP-9

18、表達(dá)較正常對(duì)照組增高(P＜0.05)，干預(yù)后，表達(dá)水平較未干預(yù)組減少(P＜0.05)，減少程度與FTS劑量無(wú)關(guān)。地塞米松組和FTS各組相比療效無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:本文從免疫機(jī)制、神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制等角度探討了Ras通路與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。通過(guò)抑制Ras信號(hào)通路可以減輕支氣管哮喘小鼠的氣道炎癥及氣道重塑，為哮喘的治療開(kāi)拓了新的思路。本研究中，F(xiàn)TS作為Ras抑制劑，與糖皮質(zhì)激素一樣，能明顯改善哮喘模型小鼠

19、氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、減少細(xì)胞因子IL-5的分泌，下調(diào)肺組織pan-ras、ERK1/2蛋白及MMP-9、MMP-2mRNA表達(dá)水平，下調(diào)脾組織GATA-3mRNA、GATA-3蛋白表達(dá)水平，上調(diào)脾組織Foxp3mRNA表達(dá)水平。減輕哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑，促進(jìn)TH1/TH2細(xì)胞平衡的恢復(fù)，增加Treg的數(shù)量及其抑制功能。其機(jī)制可能是通過(guò)抑制不同的Ras下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路，從而調(diào)節(jié)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，最終發(fā)揮治療哮喘的作用。但哮喘的