人羊膜上皮細(xì)胞和或潤肺止嗽丸對COPD模型大鼠細(xì)胞凋亡、氣道重塑的影響.pdf

1、目的:慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pul-monary disease，簡稱慢阻肺、COPD)是慢性反復(fù)發(fā)作性呼吸系統(tǒng)疾病之一。
　　實(shí)驗(yàn)用人羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)源于胎盤羊膜組織，文獻(xiàn)報道其具有抗炎以及減少急性肺損傷的作用。中成藥潤肺止嗽丸為經(jīng)典方劑，具有理氣、補(bǔ)氣、止嗽、化痰作用，臨床多用于有慢性咳嗽、氣喘等癥狀的呼吸道疾病;
　　本文通過多個實(shí)驗(yàn)研究探討hAEC、潤肺止嗽丸、hAEC聯(lián)

2、合潤肺止嗽丸治療是否對COPD大鼠有逆轉(zhuǎn)作用，觀察hAECs和潤肺止嗽丸對COPD模型大鼠在病理形態(tài)、炎癥因子、細(xì)胞凋亡、氣道重塑等方面的影響以及早期干預(yù)對COPD形成的影響。以闡述hAECs和潤肺止嗽丸對COPD大鼠干預(yù)的作用機(jī)理，以及作用于COPD大鼠的治療途徑。
　　方法:
　　1.運(yùn)用煙熏法聯(lián)合氣管內(nèi)滴注脂多糖的制作方法建立COPD大鼠模型。從新鮮人胎盤中提取hAECs并進(jìn)行鑒定。
　　2.將清潔級Wistar

3、大鼠64只（雄性）通過隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組、潤肺止嗽丸提前治療組、hAECs提前治療組、潤肺止嗽丸治療1個月和3個月組，以及hAECs組、潤肺止嗽丸聯(lián)合hAECs治療組共8組。
　　3.通過用潤肺止嗽丸灌胃、使用hAECs氣管滴入治療后，進(jìn)行血清檢驗(yàn);肺泡灌洗、收集肺泡灌洗液，并切取活體肺組織。
　　4.光鏡下觀察COPD大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化及其肺氣腫程度、氣管平滑肌的厚度。
　　5.應(yīng)用放免法測定各組大鼠血及

4、組織中白介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子(TNF-a)。
　　6.應(yīng)用ELISA法測定大鼠血及組織中肺表面活性蛋白-D(SP-D)水平及BALF中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平。
　　7.Western blot法檢測肺組織中VEGF和血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR2）的蛋白表達(dá)。
　　8.TUNEL法標(biāo)記，觀察各組凋亡細(xì)胞數(shù)。
　　9.雙抗體夾心ABC-ELISA法測定肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)。

5、
　　10.RT-PCR半定量分析法測大鼠肺組織MMP2、MMP8表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.光鏡下的各組大鼠肺組織及細(xì)支氣管病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
　　1.1.正常組:氣管黏膜纖毛無變短、脫落現(xiàn)象、纖毛排列整齊，管腔內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞浸潤、無黏液栓形成;細(xì)支氣管僅見少量杯狀細(xì)胞，周圍無肺泡變薄、膨大，未見腺體增生、管壁水腫及氣道平滑肌增厚現(xiàn)象。
　　1.2.模型組:氣管黏膜纖毛變短、部分氣道有脫落現(xiàn)象，纖毛排列

6、不齊，管腔內(nèi)可見淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤;氣道內(nèi)可見黏液栓形成及炎性細(xì)胞浸潤，周圍肺組織有肺泡擴(kuò)大，泡壁變薄、斷裂。細(xì)支氣管管壁增厚、平滑肌增生、管腔狹窄，分布較多杯狀細(xì)胞。
　　1.3.潤肺止嗽丸及hAECs提前干預(yù)組:與COPD模型組相比，部分支氣管管腔增厚，管腔內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞及浸潤，粘液栓形成減少，較少纖維組織增生，各級支氣管壁、血管粘膜下和周圍肺組織炎性細(xì)胞浸潤減輕，肺泡破壞數(shù)目少，細(xì)支氣管平滑肌有增厚。
　　1

7、.4.hAECs組:氣管粘膜纖毛排列相對整齊，有少量纖毛倒伏，管壁內(nèi)較COPD模型組炎性細(xì)胞浸潤較少、管壁增厚減輕，有少量肺大泡形成。
　　1.5.潤肺組:氣管管腔增厚情況減輕，粘液栓形成減少，纖維組織增生減輕，細(xì)支氣管壁、血管粘膜下和周圍肺組織炎性細(xì)胞浸潤減輕，周圍肺泡破壞數(shù)目減少，周圍血管有部分充血水腫。
　　1.6.hAECs+潤肺組:氣管黏膜纖毛排列相對整齊、氣道有少量炎細(xì)胞浸潤;部分肺泡壁變薄或斷裂，氣道內(nèi)較少黏液

8、栓，氣管周圍肺泡破壞較少。細(xì)支氣管平滑肌部分增厚。
　　1.7.潤肺3個月組:氣管黏膜上皮有少部分脫落，纖毛排列整齊，管壁見少量炎細(xì)胞浸潤;細(xì)支氣管腔內(nèi)有少量黏液，管壁有部分增厚，平滑肌有增生現(xiàn)象。較COPD模型組相比有較少肺泡膨大，泡壁變薄。
　　2.各組MLI、MAN變化
　　2.1.正常組與模型組MLI、MAN比較有顯著性差異P＜0.01。說明模型組COPD成立。
　　2.2.hAECs提前組、潤肺提前組與

9、模型組比較MLI、MAN值均P＜0.05。說明提前干預(yù)使肺氣腫減輕。
　　2.3.模型組與各治療組MLI、MAN比較P＜0.05。各治療組肺氣腫較模型組輕，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異。
　　2.4 hAECs組與潤肺組MLI、MAN比較有顯著性差異P＜0.05。hAECs組較潤肺組肺氣腫較輕，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.5.hAECs組與hAECs+潤肺組比較MLI值P＜0.05，MAN值P＞0.05。說明hAECs組增加潤肺治療后肺氣

10、腫改善不明顯。潤肺組與hAECs+潤肺組比較，MLI、MAN值均P＜0.01。潤肺組聯(lián)合hAECs治療后肺氣腫明顯改善。
　　2.6.潤肺組與潤肺3月組MLI、MAN值比較P＜0.05。延長治療較短期治療更能改善肺氣腫。
　　3.各組大鼠炎癥因子IL-8、TNF-a及SP-D血液及組織檢測結(jié)果
　　3.1.正常組與模型組血、組織中SP-D、IL-8、TNF-α的比較P＜0.01。說明正常組血、組織中SP-D、IL-8、

11、TNF-α含量少。
　　3.2.hAECs提前組、潤肺提前組與模型組血及組織中SP-D、IL-8、TNF-α比較
　　提前治療組可以明顯降低血及組織中IL-8、TNF-α的水平，與模型組比較P＜0.05、P＜0.01，說明早期干預(yù)治療能夠抑制炎癥因子。血及組織中SP-D的影響不明顯，與模型組比較P＞0.05，推斷在COPD形成早期炎癥反應(yīng)更明顯。
　　3.3.模型組與hAECs組、潤肺組、hAECs+潤肺組、潤肺3個月

12、血及組織中SP-D、IL-8、TNF-α比較
　　血及組織中SP-D:各治療組與模型組比較均P＜0.05說明治療組可以延緩COPD病情。hAECs組與潤肺組比較P＜0.05，說明降低SP-D水平優(yōu)于潤肺組，與hAECs+潤肺組比較P＞0.05，hAECs增加潤肺治療對降低SP-D效果不明顯。
　　潤肺組與hAECs+潤肺組比較P＜0.05，說明潤肺止嗽丸增加hAECs治療后可明顯降低SP-D，使病情得到緩解。潤肺組與潤肺3個

13、月組比較P＜0.01，即延長治療較短期治療更有效。
　　血及組織中IL-8、TNF-α:各治療組與模型組比較均P＜0.05，說明模型組血及組織中IL-8、TNF-α含量較高。各治療組可降低IL-8、TNF-α含量;hAECs組與潤肺組比較，降低IL-8、TNF-α優(yōu)于潤肺組P＜0.01，而hAECs增加潤肺止嗽丸治療并不能明顯降低IL-8、TNF-α的水平P＞0.05;潤肺組增加hAECs治療后較單純潤肺組可明顯降低IL-8、TN

14、F-α水平P＜0.01。潤肺組與潤肺3個月組比較P＜0.01，說明延長治療有效抑制炎癥因子。
　　4.各組肺組織細(xì)胞凋亡情況及凋亡指數(shù)。
　　5.各組Western blot法檢測肺組織VEGF和VEGFR2蛋白表達(dá)。
　　6.各組BALF中VEGF含量比較
　　模型組BALF中的VEGF含量明顯低于正常組P＜0.05，說明BALF中的VEGF含量低，經(jīng)過治療各治療組的VEGF含量均有所增加P＜0.05。

15、　　7.各組測量平滑肌厚度比較
　　模型組平滑肌厚度明顯高于正常組P＜0.01，通過干預(yù)各治療組的平滑肌厚度減輕P＜0.05。hAECs組較潤肺組平滑肌厚度減輕P＜0.05，與hAECs+潤肺組比較P＞0.05，無差異。潤肺組較hAECs+潤肺組氣道平滑肌厚度稍重P＜0.05，與潤肺治療3個月比較P＜0.05，說明協(xié)同治療及延長潤肺止嗽丸治療可以減輕平滑肌厚度。
　　8.模型組MMP2、MMP8蛋白表達(dá)明顯高于正常組，各治療

16、組均較模型組表達(dá)低，hAECs+潤肺組MMP2、MMP8蛋白較潤肺3個月組表達(dá)降低;hAECs組MMP2、MMP8表達(dá)較潤肺組均低;hAECs組、潤肺組均高于hAECs+潤肺組。
　　9.模型組肺組織勻漿液TGF-β1含量高于各治療組P＜0.05。
　　hAECs組TGF-β1含量較潤肺組低P＜0.05。增加潤肺止嗽丸治療并不能減少TGF-β1含量P＞0.05。潤肺止嗽丸聯(lián)合hAECs治療較單純潤肺治療可以明顯降低TGF-β

17、1水平。潤肺3個月降低TGF-β1水平優(yōu)于1個月組P＜0.01。
　　結(jié)論:
　　1.使用煙熏及脂多糖氣管滴入法可復(fù)制COPD模型。COPD大鼠模型存在著氣道炎癥、細(xì)胞凋亡及氣道重塑。氣道重塑通過干預(yù)具有可逆性。
　　2.在造模同時給與hAECs和潤肺止嗽丸，可以降低炎癥因子IL-8、TNF-α，減少肺大泡的形成，延緩COPD進(jìn)程，但對SP-D無明顯影響，推測在COPD形成早期炎癥更明顯。
　　3.hAECs、潤