芪丹通脈片干預(yù)VEGF的內(nèi)皮雙向作用的機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景與目的
　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF，VEGFA）是促血管新生的關(guān)鍵而有力的調(diào)節(jié)因子之一。作為一種旁分泌蛋白質(zhì)，VEGF具有抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和提高血管通透性等作用，是影響血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要分子。目前，人們對(duì)VEGF生物學(xué)作用的雙面之爭(zhēng)已成熱點(diǎn)。一方面，無(wú)論在體內(nèi)還是在體外，VEGF都是內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)促存活因子。缺血、缺氧均可誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)和分泌。低氧可提高局部組織旁分泌VEGF，并作用在內(nèi)皮細(xì)

2、胞的VEGF受體上，刺激新血管的形成，以適應(yīng)性調(diào)節(jié)局部血氧的供應(yīng)。但是在另一方面，在冠心病、腫瘤、中風(fēng)、糖尿病等許多疾病狀態(tài)下，這一適應(yīng)性調(diào)節(jié)會(huì)發(fā)生紊亂，VEGF的“保護(hù)性角色”反而轉(zhuǎn)變成主要的致病性病理性因素。在針對(duì)這一爭(zhēng)論的討論中，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的依據(jù)提示VEGF量的改變與其不同的生物學(xué)效應(yīng)關(guān)系密切。已知，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2，F(xiàn)lk-1/KDR)是VEGF發(fā)揮內(nèi)皮相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)的主要受體之一，VEGF激活作

3、用下的KDR表達(dá)和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)控著內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)新生血管信號(hào)的敏感性，以及下游分子的信號(hào)傳導(dǎo)。
　　傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有趨利避害性調(diào)節(jié)和維護(hù)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)平衡的優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血類中藥對(duì)VEGF表達(dá)和分泌有雙面干預(yù)作用。一方面，益氣活血中藥通過(guò)下調(diào)VEGF分泌和表達(dá)而抑制腫瘤血管生成及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，減少組織的血供，抑制腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及對(duì)機(jī)體有害的病理發(fā)展；另一方面，益氣活血中藥通過(guò)上調(diào)VEGF分泌和表達(dá)促進(jìn)血管新生及血管內(nèi)皮細(xì)胞的

4、修復(fù)，在治療缺血類疾病中獨(dú)具特色。
　　既往實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芪丹通脈片（QDTMT）具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，可提高心肌缺血大鼠心室內(nèi)VEGF表達(dá)，增加缺血區(qū)的微血管密度（MVD）。但是，在缺氧狀態(tài)下，QDTMT是否對(duì)內(nèi)源性VEGF分泌和表達(dá)水平存在雙向調(diào)節(jié)，是否對(duì)其受體KDR也有調(diào)節(jié)作用尚屬未知。
　　以往關(guān)于活血化瘀中藥影響VEGF的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，基本上都設(shè)計(jì)在急性缺氧期，而有關(guān)VEGF影響血管增生的實(shí)驗(yàn)研究大多設(shè)計(jì)在疾病的病理改

5、變形成后，后者需要的實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間較長(zhǎng)。因此，要進(jìn)一步明確益氣活血化瘀復(fù)方中藥制劑干預(yù)VEGF不同生物效應(yīng)的具體作用機(jī)制，還需要對(duì)疾病不同時(shí)段進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。
　　為此，本研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分選用了便于動(dòng)態(tài)觀察的低壓氧艙性大鼠缺氧模型。經(jīng)QDTMT藥物干預(yù)后，我們選擇不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)測(cè)量了大鼠血清中的VEGF濃度變化，并相應(yīng)觀察了與本實(shí)驗(yàn)相關(guān)性較強(qiáng)的大鼠心、肝、肺多個(gè)組織內(nèi)血管的病理形態(tài)改變。
　　因?yàn)榻咏幬镌隗w內(nèi)作用的真實(shí)過(guò)程，

6、血清藥理學(xué)研究方法近些年發(fā)展迅速，本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)中對(duì)此部分內(nèi)容也有所借鑒。在制備了QDTMT含藥血清后，為進(jìn)一步探討QDTMT的KDR相關(guān)分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)還加入了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。通過(guò)培養(yǎng)并鑒定臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），觀察了QDTMT含藥血清對(duì)低氧條件下的內(nèi)皮細(xì)胞一般形態(tài)，超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞活性的影響，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)KDR的表達(dá)變化進(jìn)行了一定的觀察。該實(shí)驗(yàn)從一定程度上證實(shí)了VEGF量的變化與其不同生物效應(yīng)間的相關(guān)性，為QDTMT血管保護(hù)作

7、用的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，豐富了中醫(yī)傳統(tǒng)理論中益氣活血法有關(guān)的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的科學(xué)內(nèi)涵。
　　二、芪丹通脈片對(duì)缺氧大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的雙向調(diào)節(jié)作用
　　1、研究方法和內(nèi)容
　　1.1動(dòng)物模型的建立與評(píng)估
　　健康雄性SD大鼠18只，置于全自動(dòng)調(diào)節(jié)低壓低氧艙，6h/d進(jìn)行缺氧造模。除觀察動(dòng)物一般情況變化外，另取肺組織標(biāo)本，HE染色觀察肺組織內(nèi)血管增生情況，對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。
　　1.2QDTMT對(duì)缺氧大鼠VEGF

8、的雙向調(diào)節(jié)及血管保護(hù)作用
　　健康雄性SD大鼠(n=30)隨機(jī)分為正常對(duì)照組、低氧+QDTMT組（QDTMT組）、低氧+生理鹽水組（生理鹽水對(duì)照組）。動(dòng)物造模方法同上，并分別在7d、14d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行以下內(nèi)容實(shí)驗(yàn)觀察。
　　1)動(dòng)物麻醉后，從腹主動(dòng)脈取血后分離血清，800rpm離心25min，分離血清，-70℃存放。使用前經(jīng)56℃、30min滅活，0.22μm濾膜滅菌，－20℃保存?zhèn)溆?。按ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行血清VEG

9、F測(cè)定。
　　2)取大鼠肺、心、肝組織，經(jīng)4％多聚甲醛固定24h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。另取材3mm3大小肝組織塊，經(jīng)戊二醛固定后，透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)改變。
　　3)VEGF免疫熒光染色無(wú)菌條件下取胸主動(dòng)脈組織，經(jīng)4％多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟制片。按常規(guī)操作順序進(jìn)行免疫熒光染色。
　　2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　2.1ELISA結(jié)果：缺氧7d大鼠血清中VEGF濃度較缺氧前增加，缺

10、氧14d大鼠血清中VEGF濃度進(jìn)一步急劇增加，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。缺氧7d，QDTMT組大鼠血清中的VEGF含量明顯高于正常對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組；而缺氧14d后，QDTMT組大鼠血清中VEGF含量低于生理鹽水對(duì)照組，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　2.2形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：光鏡下可見(jiàn)，缺氧7d大鼠肺內(nèi)血管結(jié)構(gòu)改變不明顯；缺氧14d大鼠肺組織血管增生明顯。QDTMT組大鼠肺、心、肝組織血管增生性改變較生理鹽水對(duì)照組輕。肝

11、組織電鏡結(jié)果提示，QDTMT組超微結(jié)構(gòu)損傷較生理鹽水對(duì)照組輕。而且，在QDTMT組大鼠肝組織內(nèi)觀察到VEGFR2相關(guān)的內(nèi)體樣超微結(jié)構(gòu)。
　　2.3VEGF免疫熒光染色結(jié)果提示，缺氧7d，三組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)層VEGF表達(dá)變化不大；缺氧14d，生理鹽水對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)觀察到大量VEGF陽(yáng)性表達(dá)，與ELISA結(jié)果相一致。
　　3、結(jié)論與提示
　　3.1低壓氧艙性缺氧模型下，大叔血清中的VEGF濃度在不同病理階段有所變化。

12、r>　　3.2QDTMT對(duì)VEGF分泌呈雙向動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用，可能是其血管保護(hù)作用主要機(jī)制之一。
　　三、芪丹通脈片對(duì)缺氧臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用研究
　　1、研究方法和內(nèi)容
　　1.1體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）及鑒定
　　參照文獻(xiàn)記載的細(xì)胞培養(yǎng)方法，從人臍靜脈分離內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)。利用顯微鏡和免疫熒光染色技術(shù)，從形態(tài)學(xué)和Ⅷ因子膜抗原鑒定培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞。
　　1.2QDTMT含藥血

13、清對(duì)缺氧HUVECs增殖、凋亡的影響
　　1.2.1制備QDTMT含藥血清
　　成年雄性SD大鼠18只，分組及處理同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分內(nèi)容。大鼠缺氧造模后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并分離血清，存放于-70℃?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)比較，確定最佳含藥血清濃度為10％后，用含100ml/L胎牛血清的M199培養(yǎng)基將3種血清的濃度均配制為10％。
　　1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性
　　選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3-5代HUVECs，用含100

14、ml/L胎牛血清的M199培養(yǎng)24h，再用無(wú)血清M199繼續(xù)培養(yǎng)6h。將細(xì)胞分為A、B、C3份：（1）A份，加入10％空白對(duì)照組大鼠血清；（2）B份，加入10％生理鹽水對(duì)照組大鼠血清；（3）C份，加入10％QDTMT組大鼠血清。除A份細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)24h外，其余兩份細(xì)胞放入三相氣體培養(yǎng)箱中，在37℃、5％CO2以及2％O2濃度條件下培養(yǎng)24h。MTT法常規(guī)操作，檢測(cè)三份細(xì)胞的活性。
　　1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

15、
　　細(xì)胞分組及處理同上，流式細(xì)胞儀常規(guī)操作測(cè)量細(xì)胞凋亡率。
　　1.3VEGFR2免疫熒光染色
　　同上處理細(xì)胞后，使用常規(guī)免疫熒光技術(shù)，觀察三份細(xì)胞中VEGFR2的表達(dá)情況。
　　1.4細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察
　　細(xì)胞同上處理，經(jīng)離心、收集后，戊二醛固定，制備電鏡標(biāo)本。透射電鏡下觀察三份細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　2.1細(xì)胞鑒定及超微結(jié)構(gòu)觀察：在倒置顯微鏡下可見(jiàn)，培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞呈典型鋪路

16、石子狀排列生長(zhǎng)。免疫熒光鑒定結(jié)果提示，培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞胞漿呈Ⅷ因子陽(yáng)性表達(dá)。透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特有的短棒狀細(xì)胞器Weible-Palade小體。
　　2.2QDTMT含藥血清對(duì)缺氧HUVECs的影響
　　1)MTT結(jié)果提示，與A份細(xì)胞相比，缺氧使B份和C份細(xì)胞增殖受到抑制；與B份相比，QDTMT含藥血清干預(yù)后的C份內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示，

17、缺氧使B、C兩份細(xì)胞的凋亡率較A份細(xì)胞凋亡率增高；QDTMT含藥血清干預(yù)后的C份內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率低于B份細(xì)胞，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　2.3免疫熒光結(jié)果提示，C份內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的VEGFR2陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)于B份細(xì)胞。
　　2.4電鏡結(jié)果提示，在C份細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)與VEGFR2轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的內(nèi)涵體結(jié)構(gòu)。
　　3、結(jié)論與提示
　　在低氧狀態(tài)下，體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率增加、增殖減少，QDTMT含