FLOW-FISH聯(lián)合檢測白血病患者端粒長度及表面分化抗原的研究.pdf

1、背景與目的： 近年來關(guān)于端粒的研究較為深入。端粒是真核生物染色體線性DNA分子末端的特殊結(jié)構(gòu)，由(TTAGGG)n反復(fù)串聯(lián)組成，其功能主要是維持染色體穩(wěn)定，其長度主要由端粒酶來維持。90年代以來，端粒及端粒酶逐漸被認(rèn)可作為腫瘤的標(biāo)記物以及抗腫瘤治療的靶點(diǎn)。有關(guān)惡性血液病患者骨髓及外周血細(xì)胞端粒長度(telomerelength，TL)及端粒酶活性的研究亦有較多報道。多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為，急性白血病初診時端粒較短而完全緩解后端粒長度可恢復(fù)

2、正常，高危核型者端?？s短更明顯，端粒短者化療緩解率相對下降，中位生存期短；CML慢性期端粒正?；蚩s短，進(jìn)展至急變期時，端粒顯著縮短，應(yīng)用STI571治療后端粒長度有所恢復(fù)，慢性期端粒短者易發(fā)生急變及對STI571耐藥；CLL早期端粒正?；蜉p度縮短，隨病情進(jìn)展，端粒不斷縮短，高危核型、高表達(dá)CD38或ZAP-70、原始IgVH基因型的患者端?？s短更明顯，端粒短者中位生存期短；MDS隨病情進(jìn)展，端粒亦縮短，且初診時端粒縮短提示易早期轉(zhuǎn)變?yōu)榧?/p>

3、性白血病。因此，了解惡性血液病患者的端粒長度對于監(jiān)測疾病狀態(tài)、評估預(yù)后、指導(dǎo)治療具有重要意義。 伴隨端粒研究的深入，有關(guān)端粒長度檢測方法的改進(jìn)，也成為臨床工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。流式熒光原位雜交是近年來發(fā)展的檢測端粒長度的新方法，國內(nèi)開展很少，國外也起步不久，主要特點(diǎn)是將流式細(xì)胞術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)結(jié)合起來。因端粒由重復(fù)序列n反復(fù)串聯(lián)組成，故其越長，在FISH中所結(jié)合的熒光素標(biāo)記的3端粒DNA序列特異性探針就越多，其熒光也就越強(qiáng)，由流

4、式細(xì)胞儀檢測的此種平均熒光強(qiáng)度即可表示端粒長度。該方法較經(jīng)典的Southern印跡雜交、定量熒光原位雜交，所需樣品量小、細(xì)胞數(shù)少，可用于檢測不分裂細(xì)胞，操作快捷，可區(qū)分同一份標(biāo)本中的不同細(xì)胞亞群，并且檢測時高通量細(xì)胞，靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。 國外的研究多利用FLOW-FISH單獨(dú)檢測端粒長度，未結(jié)合患者白血病細(xì)胞表面分化抗原的表達(dá)特點(diǎn)，研究結(jié)果多提示整個細(xì)胞群端粒長度變化的均值，而不能區(qū)分端粒明顯縮短、但為數(shù)極少的白血病

5、細(xì)胞與端粒長度正常、但占絕大對數(shù)的正常細(xì)胞，因此在白血病微小殘留病(minimalresidualdisease，MRD)檢測時意義可能有限。此外，隨著疾病進(jìn)展、治療實施，白血病患者的造血組織中同時存在的正?？寺『彤惓？寺≈g、異常克隆的不同亞克隆之間可能發(fā)生“消”與“漲”，并且出現(xiàn)復(fù)發(fā)時白血病細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)可發(fā)生變化，可能出現(xiàn)系列的轉(zhuǎn)變，此時如果單獨(dú)檢測端粒長度，則難以盡早地對這種克隆演變進(jìn)行監(jiān)測。另一方面，單獨(dú)檢測細(xì)胞表面分化抗原

6、，雖然在初發(fā)白血病的免疫學(xué)中意義重大，但追蹤MRD時，則很難區(qū)分表達(dá)同樣分化抗原的白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞，難以對白血病MRD進(jìn)行真正準(zhǔn)確的判斷。MRD是白血病監(jiān)測的重要內(nèi)容，而不是所有的患者都具有某種特異性的細(xì)胞遺傳學(xué)或分子生物學(xué)標(biāo)記，大部分患者沒有很好的MRD檢測指標(biāo)，因此尋找一個可廣泛應(yīng)用的方法非常必要和迫切。FCM通過自血病相關(guān)免疫表型檢測MRD具有其顯著優(yōu)勢，制約其廣泛開展的主要原因如上所述，即不能區(qū)分造血細(xì)胞中的正?？寺『蜌?/p>

7、存的異?？寺?，因此如能尋找一個能夠區(qū)分正常和異常克隆的指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測，結(jié)合FCM具有的適用范圍廣、操作快捷、價格相對便宜、信息量大、易于直接準(zhǔn)確定量的優(yōu)勢，將為臨床白血病的監(jiān)測、診治提供極大的幫助。 本課題設(shè)想，在本實驗室建立較穩(wěn)定可靠的檢測細(xì)胞端粒長度的FLOW-FISH方法，初步觀察由此測定的端粒長度與白血病的關(guān)系，探討有關(guān)的白血病發(fā)生發(fā)展機(jī)制。此外，應(yīng)用FLOW-FISH檢測端粒長度的同時，檢測同一標(biāo)本中有關(guān)細(xì)胞表面分化

8、抗原的表達(dá)情況，以期使單純的FCM技術(shù)和FISH技術(shù)得到有機(jī)結(jié)合，從而使白血病細(xì)胞的免疫表型異常與端粒長度異常結(jié)合起來，協(xié)同作為監(jiān)測疾病狀態(tài)、評估預(yù)后的指標(biāo)，進(jìn)而尋找一個可以廣泛應(yīng)用的監(jiān)測白血病MRD的新方法，為進(jìn)一步的診療計劃提供依據(jù)。 方法： 1.培養(yǎng)HL60、Raji、Molt4細(xì)胞株，對FLOW-FISH檢測細(xì)胞端粒長度及聯(lián)合檢測表面分化抗原各個實驗步驟進(jìn)行摸索、優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)化，克服有關(guān)技術(shù)難點(diǎn)，制定相關(guān)操作規(guī)程及

9、分析策略。臨床標(biāo)本相對端粒長度(relativetelomerelength，RTL)以標(biāo)本相對于同批上機(jī)的Molt4細(xì)胞株的端粒平均熒光強(qiáng)度(平均熒光道數(shù)值)的比值表示. 2.研究對象：所有白血病標(biāo)本均取自經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)確診的34例患者。對照組為年齡、性別匹配的健康者20例。 3.提取白血病患者骨髓及健康對照者外周血單個核細(xì)胞，分組進(jìn)行FLOW-FISH。14例急性白血病患者治療前后均聯(lián)合檢測細(xì)胞端

10、粒長度和表面分化抗原，分化抗原根據(jù)初發(fā)時免疫分型選擇表達(dá)較高者，其中11例AML均高表達(dá)CD33(>20％)，3例ALL均高表達(dá)CD19(>70％)。其余無治療后緩解配對的20例患者和20例健康對照者單獨(dú)檢測細(xì)胞端粒長度。同時應(yīng)用RQ-PCR方法檢測同一批標(biāo)本的端粒長度，與FLOW-FISH方法進(jìn)行對照。比較白血病患者與健康對照者端粒長度的差異；初步分析端粒長度與白血病臨床特征、預(yù)后的關(guān)系；追蹤部分病例，觀察不同病程中端粒長度與表面分化

11、抗原的變化情況。 4.應(yīng)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。兩組計量資料間分布比較用Mann-WhitheyUtest；配對計量資料間分布比較用Wilcoxonsignedranktest；兩組以上計量資料間分布比較用Kruskal-Wallistest；兩變量間相關(guān)分析采用Spearmanrankcorrelationanalysis；率的比較采用x2test。檢驗水準(zhǔn)a=0.05，雙側(cè)檢驗。 結(jié)果： 1.利用

12、不同細(xì)胞株建立了較穩(wěn)定可靠的FLow-FISH檢測細(xì)胞端粒長度的實驗方法，同時成功建立了FLOW-FISH檢測細(xì)胞端粒長度的同時應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測表面分化抗原的實驗方法。 2.24例急性白細(xì)胞患者端粒相對平均熒光強(qiáng)度(代表相對端粒長度RTL)中位數(shù)為0.240，2例CLL患者為0.235，3例CML-BP患者為0.249，5例CML-CP患者為0.435，20例健康對照者為0.408。各組間存在顯著差異(x2=18.403，P=

13、0.001)，其中急性白血病、CLL及CML-BP組患者較健康對照者端粒顯著縮短，而CML-CP組患者與健康對照者相比，端粒長度處于相同水平。14例化療后獲完全緩解(CR)的急性白血病患者CR后端粒顯著延長(Z=-3.233，P0.001)，而CR后端粒長度與健康對照者相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(U=114.0，P=0.363)。FLOW-FISH檢測的端粒相對平均熒光強(qiáng)度(RTL)與RQ-PCR檢測的端粒T/S比值(亦代表端粒長度)顯著相

14、關(guān)(rs=0.860，P=0.000)。 3.20例健康對照者中，端粒長度隨年齡增長而縮短(rs=-0.671，P=0.001)，年齡無顯著差異女性較男性端粒長(U=22.0，P=0.037)。而在34例初發(fā)白血病患者中，端粒長度與年齡、性別不相關(guān)。24例急性白血病患者中，端粒長度與外周血白細(xì)胞計數(shù)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(rs=-0.597，P=0.002)，與血紅蛋白含量、血小板計數(shù)無明顯相關(guān)性。在可隨訪的23例急性白血病患者中，端粒

15、長度大于中位數(shù)者初治CR率為81.82％，小于中位數(shù)者為58.23％。5例CML-CP患者均服用STI571治療，其中2例端粒長度較短者(RTL0.254～0.232)半年內(nèi)急變，另3例端粒長度處于正常水平者(RTL0.435～0.598)3個月內(nèi)獲CHR，6個月獲CCyR，隨訪10個月內(nèi)未發(fā)生急變。 4.14例聯(lián)合檢測表面分化抗原的初發(fā)急性白血病患者，抗原表達(dá)率與常規(guī)免疫分型結(jié)果一致，CR后均表達(dá)下降。5例動態(tài)聯(lián)合檢測的患者中

16、，2例長期CR者在緩解后端粒長度恢復(fù)，在緩解期始終處于正常水平，且無特異抗原表達(dá)增高。3例復(fù)發(fā)者均表現(xiàn)為在起病時端粒顯著縮短，CR后較前延長，復(fù)發(fā)后再次縮短，同時特異抗原表達(dá)增高，其中2例患者相關(guān)抗原陽性細(xì)胞群端粒的縮短先于整個細(xì)胞群端粒長度的變化，先于骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)論： 1.建立了FLOW-FISH及RQ-PCR(2-△△CT法)兩種檢測細(xì)胞端粒長度的實驗方法。 2.建立了FLOW-FISH檢測細(xì)胞端

17、粒長度的同時應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測表面分化抗原的實驗方法。 3.34例初發(fā)白血病患者中，除CML-CP患者，其余端粒長度均較同年齡健康對照組顯著縮短。其中14例化療CR后急性白血病患者端粒長度恢復(fù)。FLOW-FISH及RQ-PCR兩種方法結(jié)論一致，且相關(guān)性良好。 4.20例健康對照者中，端粒長度隨年齡增長而縮短，女性較男性端粒長。而在初發(fā)白血病患者中，端粒長度與年齡、性別不相關(guān)，與外周血白細(xì)胞計數(shù)成負(fù)相關(guān)。在可隨訪的23例急