高濃度氧誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化致未成熟腦損傷及脂多糖致敏效應(yīng)的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述。
　　第一部分高度氧暴露對N9小膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響。
　　目的:探討高濃度氧暴露對N9小膠質(zhì)細(xì)胞生存能力及氧化應(yīng)激、促炎癥反應(yīng)功能的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)N9小膠質(zhì)細(xì)胞，建立高濃度氧損傷細(xì)胞模型，在95％高氧暴露2h、6h、12h、16h、24h后(1)觀察N9小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化;(2) DHE熒光探針觀測超氧化陰離子的變化;(3) DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化;

2、(4)RT-PCR檢測TLR4及TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)的變化;(5)免疫熒光化學(xué)染色觀測TLR4蛋白表達(dá)的變化;(6) ELISA檢測細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β的含量;(7)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞存活率及凋亡率。
　　結(jié)果:高濃度氧暴露后N9小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)由靜息態(tài)轉(zhuǎn)化為激活態(tài)，細(xì)胞內(nèi)ROS、超氧陰離子較對照組在高氧暴露2h后即有增高（P＜0.05），并隨暴露時間延長而增加;TLR4及TNF-α、IL-1β mRNA

3、表達(dá)均在一定時間范圍內(nèi)呈時間依賴性增強(qiáng)(P＜0.05)，但表達(dá)時序上存在差異，TLR4 mRNA在2h開始上調(diào)，TNF-α、IL-1β mRNA均在6h上調(diào);免疫熒光化學(xué)染色顯示高氧暴露12h后TLR4表達(dá)較對照組增強(qiáng)，主要在胞漿、胞膜上表達(dá);細(xì)胞上清內(nèi)TNF-α、IL-1β均在高氧暴露6h后隨時間延長而增加(P＜0.05);高氧暴露12h后細(xì)胞凋亡率較對照組增加(P＜0.05)，16h最高。
　　結(jié)論:高氧暴露激活體外培養(yǎng)的N9

4、小膠質(zhì)細(xì)胞，增強(qiáng)氧化應(yīng)激、促炎癥反應(yīng)，并能導(dǎo)致自身凋亡;高氧暴露后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可能存在ROS-TLR4-促炎性介質(zhì)釋放途徑激活。
　　第二部分脂多糖處理后高濃度氧對小膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響及分子機(jī)制研究。
　　目的:探討LPS與高濃度氧對小膠質(zhì)細(xì)胞的共同效應(yīng)，及氧化應(yīng)激、TLR4信號通路在高濃度氧活化小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用。
　　方法:體外培養(yǎng)N9小膠質(zhì)細(xì)胞（TLR4野生型）及EOC20小膠質(zhì)細(xì)胞（TLR4敲出型），建立不同濃

5、度LPS處理后高氧損傷N9細(xì)胞模型，95％高氧暴露2h、6h、12h、16h、24h后(1)DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化;(2) RT-PCR檢測TLR4 mRNA表達(dá)時序變化;(3) Western-blot檢測TLR4蛋白表達(dá);(4) ELISA檢測細(xì)胞上清中TNF-α含量。通過抗氧化劑NAC干預(yù)、TLR4功能缺失(EOC20)觀測95％高氧暴露后ROS含量、NF-κ B核轉(zhuǎn)錄活性、細(xì)胞上清中TNF-α含量變化。

6、
　　結(jié)果:高濃度氧暴露可增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的N9小膠質(zhì)細(xì)胞ROS活性，TNF-α表達(dá)明顯增高，同時下調(diào)TLR4的表達(dá)，呈一定時間依賴性，且調(diào)控幅度與LPS濃度有關(guān)，高濃度較低濃度高氧暴露后變化更為顯著。抗氧化劑NAC干預(yù)后，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B活性明顯降低，細(xì)胞上清內(nèi)TNF-α水平亦顯著下調(diào)，EOC20高濃度氧暴露后呈現(xiàn)出相識的變化，并且二者結(jié)合效應(yīng)更為顯著。
　　結(jié)論:LPS處理后高氧暴露對小膠質(zhì)細(xì)胞活化具有協(xié)同效應(yīng)，RO

7、S或TLR4可成為調(diào)控高濃度氧對小膠質(zhì)細(xì)胞生物效應(yīng)的關(guān)鍵分子，二者結(jié)合作用更加顯著。
　　第三部分脂多糖致敏高濃度氧對新生小鼠未成熟腦損傷的研究。
　　目的:探討低濃度LPS處理后高濃度氧對新生小鼠未成熟腦損傷的影響及其作用機(jī)制
　　方法:48只PND3新生小鼠分為空氣組、LPS處理組、高氧組、高氧+LPS組，高氧+LPS組采用LPS腹腔注射(0.3mg/kg)30min后95％高濃度氧暴露24h，LPS處理組、高氧組

8、給予相應(yīng)單因素處理，PND5斷頭取腦:(1) Tomato lectin免疫組化染色觀測腦室周圍白質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化;(2)檢測腦組織內(nèi)脂質(zhì)氧化物MDA含量;(3) real-timePCR檢測TNF-α mRNA表達(dá)變化;(3) western-blot檢測capsase-3蛋白表達(dá);(5)電鏡觀察腦室周圍白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果:Tomato lectin染色顯示LPS組、高氧組及LPS+高氧組均可見腦室周圍白質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)