H2S對高濃度ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、背景：
　　三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）是體內(nèi)重要的能量分子及嘌呤神經(jīng)遞質(zhì)，可激活P2受體調(diào)節(jié)大腦功能，特別是P2X7受體，激活后可引起細(xì)胞迅速去極化，引發(fā)胞外Ca2+內(nèi)流，影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)。而反復(fù)持續(xù)的刺激P2X7受體可使其形成大的膜孔，允許900D以下有機(jī)陽離子及ATP本身自由通過。細(xì)菌脂多糖(LPS)處理會引起膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)白介素-1β前體（pro-IL-1β）急劇增

2、多并逐漸聚集，隨后施加ATP能刺激白介素-1β(IL-1β)的成熟與分泌，促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展。
　　硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S)是繼CO、NO后被人們認(rèn)可的第三氣體信號分子，近年來的研究結(jié)果證實(shí)H2S對損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用。然而H2S的保護(hù)作用是否與ATP-P2X嘌呤信號通路有關(guān)則鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在研究ATP-P2X嘌呤信號通路的基礎(chǔ)上探究H2S的影響及作用機(jī)制，試圖明確二者間的聯(lián)系并發(fā)現(xiàn)H2S神經(jīng)保護(hù)作用

3、的重要分子機(jī)制與靶點(diǎn)。
　　目的：
　　制備ATP損傷大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞模型，探討硫化氫(H2S)對抗ATP誘導(dǎo)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用和機(jī)制。
　　方法：
　　1 NaHS對ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響
　　1.1含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)取對數(shù)期分化較好的細(xì)胞，吹打均勻，以1×105/L的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃，5％CO2培養(yǎng)24h，隨機(jī)分為4組:

4、(1)空白對照組:只含培養(yǎng)基，不含細(xì)胞。(2)正常對照組:大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不給予ATP處理（即0mmol/L ATP）。(3) ATP組（分別用0.3 mmol/L、1 mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L ATP）。不同濃度的ATP誘導(dǎo)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞3h， MTT法檢測細(xì)胞存活率。
　　1.2細(xì)胞處理方法同1.1，隨機(jī)分為5組，正常對照組、ATP組、NaHS(100、200、400μmol/L)

5、+ATP組。不同濃度的NaHS預(yù)孵育30 min后再加入3mmol/L ATP處理3h，并且NaHS始終存在于反應(yīng)體系中。MTT法檢測每組細(xì)胞存活率，0mmol/L ATP組為對照組，其存活率定為100％。
　　2 NaHS對ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞膜孔形成的影響
　　2.1對數(shù)期分化良好的細(xì)胞吹打均勻后，以1×105/L的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為:正常對照組，ATP組(0.3 mmol/L、1 mmol/L

6、、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/LATP)。ATP與YO-PRO-1（2μmol/L）同時(shí)加入體系作用1h后，酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度。2.2對數(shù)期分化良好的細(xì)胞吹打均勻后，以1×105/L的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為4組，正常對照組、ATP組、NaHS+ ATP組、KN-62（P2X7受體拮抗劑）+ATP組。其中ATP為3mmol/L，NaHS為200μmol/L，KN-62為500nmol/L。NaHS或KN-

7、62預(yù)孵育30min后，同時(shí)加入ATP和YO-PRO-1作用1小時(shí)，酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度。
　　3 NaHS對ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體表達(dá)的影響
　　對數(shù)期分化良好的細(xì)胞吹打均勻接種于60mm培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分為3組，正常對照組、ATP(3mmol/L)組、NaHS（200μmol/L）+ATP組。Western blotting檢測P2X7受體表達(dá)水平。
　　4 NaHS對ATP-LPS激活的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞

8、IL-1β釋放的影響
　　對數(shù)期分化良好的細(xì)胞吹打均勻后接種于60mm培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分為5組，正常對照組、ATP組、LPS組、ATP+ LPS組、NaHS+ ATP+ LPS組。其中ATP為3mmol/L，LPS為1μg/mL，NaHS為200μmol/L。藥物處理順序依次為首先使用NaHS預(yù)孵育30min，加入LPS處理9h后，再給予ATP處理3h(即各組LPS處理時(shí)間均為12h)，全部藥物處理結(jié)束后，收集各組細(xì)胞上清液，離心后

9、依照試劑盒說明書操作，檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β含量。
　　結(jié)果：
　　1 NaHS對ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響
　　1.1不同濃度的ATP對大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響以正常對照組細(xì)胞存活率為100％，0.3mmol/L ATP組細(xì)胞存活率為95.17％，與對照組無明顯差異(P＞0.05)。但1 mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L ATP組細(xì)胞存活率分別為83.03％、7

10、2.13％、68.40％、52.50％，都明顯低于對照組，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　1.2不同濃度的NaHS對ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響分別給予100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L NaHS預(yù)孵育30min后，再加入3mmol/L ATP處理3h。以正常對照組細(xì)胞存活率100％，100μmol/LNaHS+ATP、200μmol/LNaHS+ATP、400μmol/LNaHS+ATP組

11、細(xì)胞存活率分別為78.41％、91.56％、82.97％，其中200μmol/LNaHS+ATP組細(xì)胞存活率明顯高于單純ATP組(P＜0.01)，表明NaHS對ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用具有濃度依賴性，濃度為200μmol/L已達(dá)到最佳，400μmol/L的保護(hù)作用沒有進(jìn)一步增加(P＞0.05)。
　　2 NaHS對ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞膜孔形成的影響
　　2.1不同濃度的ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞膜孔形成

12、酶標(biāo)儀檢測胞內(nèi)YO-PRO-1(分子量625D)熒光強(qiáng)度代表膜孔形成。分別給予0mmol/L、0.3mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L ATP作用大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞1h，以正常對照組(0mmol/LATP組)熒光強(qiáng)度為100％，其他各組分別為100.31％、107.86％、112.96％、143.17％、151.82％。其中3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L ATP組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度均

13、顯著高于正常對照組(P＜0.05)。表明，ATP可以引起大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞膜孔形成，且胞內(nèi)YO-PRO-1熒光增強(qiáng)取決于ATP濃度，也即具有濃度依賴性。
　　2.2 NaHS與KN-62對ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞膜孔形成的影響使用NaHS或KN-62預(yù)孵育后，再給予ATP處理，兩組細(xì)胞內(nèi)YO-PRO-1熒光強(qiáng)度分別為101.17％、102.23％，均明顯低于3mmol/L ATP組的熒光強(qiáng)度(P＜0.01)。說明NaHS及KN-62

14、都能明顯對抗ATP誘導(dǎo)的膜孔形成，降低細(xì)胞對YO-PRO-1遙透。
　　3 NaHS對ATP誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體表達(dá)的影響
　　Western blotting結(jié)果顯示，3mmol/L ATP處理3h后，大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體蛋白表達(dá)明顯增加。而先給予200μmol/L NaHS預(yù)孵育后再加入ATP，P2X7受體蛋白表達(dá)水平較單純ATP處理組相比明顯下降(P＜0.05)，顯示NaHS能抑制ATP誘導(dǎo)的P2X7

15、受體蛋白的表達(dá)。
　　4 NaHS對ATP-LPS激活的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β的影響
　　檢測細(xì)胞上清液內(nèi)IL-1β水平來反映大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。結(jié)果單純ATP處理組或LPS處理組細(xì)胞上清液內(nèi)IL-1β水平與對照組相比均無明顯差異(P＞0.05)。而ATP+LPS組無論與單純ATP處理組相比還是與LPS處理組相比，IL-1β水平均有明顯升高(P＜0.05)。但在ATP+LPS組處理前30min加入NaHS，細(xì)胞上清液

16、IL-1β水平則明顯低于ATP+LPS組(P＜0.05)。表明ATP或LPS均不能引起大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β的釋放，而ATP與LPS的聯(lián)合作用則能激活大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放IL-1β，NaHS預(yù)孵育能抑制ATP與LPS聯(lián)合引發(fā)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及IL-1的釋放。
　　結(jié)論：
　　胞外高濃度的ATP可降低大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活力、上調(diào)P2X7受體表達(dá)、促進(jìn)膜孔形成;ATP與LPS聯(lián)合作用可激活大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，增多IL-1β的釋放