H2S預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 肝臟缺血/再灌注損傷(HI/RI)是肝移植術(shù)、肝切除等需要阻斷肝臟血流的外科手術(shù)中常見的病理生理過程，嚴(yán)重影響手術(shù)效果和患者的預(yù)后。已有研究證明：氧自由基和活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)過量生成、能量代謝障礙、鈣超載、中性粒細(xì)胞浸潤和線粒體功能障礙等機(jī)制均參與了肝臟缺血/再灌注損傷的病理生理過程。
　　 硫化氫(H2S)是氣體信號(hào)分子家族一員，具有抗氧化、抗炎癥和抗凋亡的作用。

2、同時(shí)，H2S也是一種毒性氣體，是細(xì)胞色素氧化酶的強(qiáng)抑制劑，能抑制電子傳遞和氧的利用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)缺氧。目前研究表明，H2S對肝臟I/R損傷具有保護(hù)作用，但其機(jī)制尚未完全明了。在肝臟I/R損傷中，H2S是否通過保護(hù)線粒體功能發(fā)揮拮抗作用，尚有一定爭議性。
　　 本實(shí)驗(yàn)用H2S的供體硫氫化鈉(NaHS)預(yù)處理大鼠肝I/R損傷，通過組織學(xué)觀察、線粒體鈣容納力測定、線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白檢測來研究H2S預(yù)處理對肝臟I/R損傷的保護(hù)作用及可能

3、機(jī)制。
　　 第一部分，H2S預(yù)處理對肝臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用
　　 通過組織學(xué)觀察和氧化還原指標(biāo)的測定明確H2S對肝臟I/R損傷的保護(hù)作用。
　　 研究方法：
　　 采用大鼠肝臟70％缺血模型，夾閉肝臟左中葉脈管系統(tǒng)，形成肝臟中葉和左葉缺血，缺血1h/再灌注24h。將SpragueDawley(SD)大鼠隨機(jī)分成4組：假手術(shù)組(Sham組)：只打開腹腔，不給予夾閉缺血；缺血再灌注組(I/R組)；物

4、理性缺血預(yù)處理組(IPC組)：缺血1h前，給予一次短暫缺血(10min/次)，中間開放血管10min；NaHS預(yù)處理組(NaHS組)：缺血前5min靜脈給予外源性H2S供體NaHS。首先選取三個(gè)NaHS濃度(1μmol/kg，25μmol/kg，37.5μmol/kg)，經(jīng)過組織學(xué)觀察，選出最適濃度。將各組肝臟組織進(jìn)行HE染色和Tunel染色，光學(xué)顯微鏡下觀察I/R后肝臟組織損傷變化和凋亡水平，對各組大鼠肝臟損傷程度和凋亡率進(jìn)行評分。取

5、新鮮的肝臟組織立即進(jìn)行谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測，觀察NaHS預(yù)處理后肝臟組織中氧化指標(biāo)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 光學(xué)顯微鏡下觀察三個(gè)濃度的NaHS預(yù)處理肝臟I/R損傷后的肝臟組織學(xué)變化，選取肝臟組織學(xué)損傷最小的NaHS濃度--25μmol/kg。觀察蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色結(jié)果，NaHS組肝臟血竇區(qū)條索樣結(jié)構(gòu)保存相對完整，組織中無或僅有少量氣球樣變性，而I/R

6、組肝臟組織正常細(xì)胞邊界消失，可見大量細(xì)胞變性壞死，IPC組損傷程度介于I/R組和NaHS組之間。與I/R組相比，NaHS組Suzuki肝臟組織學(xué)評分顯著下降(1.667±0.52VS2.667±0.52，P＜0.05)。Tunel染色結(jié)果顯示，與I/R組相比，NaHS組凋亡率顯著下降(13.9％±0.045％VS.38.6％±0.07％，P＜0.05)。檢測GSH含量結(jié)果顯示，與I/R組相比，NaHS組肝臟組織中GSH含量顯著升高(P＜

7、0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 25μmol/kgNaHS預(yù)處理肝臟I/R損傷，肝臟損傷明顯減輕，細(xì)胞凋亡顯著下降，組織中GSH含量升高，提示H2S對肝臟I/R損傷的保護(hù)作用與其介導(dǎo)產(chǎn)生GSH，拮抗肝臟I/R后的氧化損傷有關(guān)。
　　 第二部分，H2S預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用--線粒體機(jī)制研究
　　 實(shí)驗(yàn)一，線粒體分離鑒定及線粒體鈣容納力檢測
　　 鑒定差速離心法分離的線粒體純度，檢測

8、大鼠肝臟I/R后肝臟組織中線粒體膜通透性。
　　 研究方法：
　　 SD大鼠隨機(jī)分為4組(處理方法同第一部分)。各組大鼠缺血1h再灌注24h后，取新鮮肝臟中葉用差速離心法制備線粒體。固定線粒體懸液，應(yīng)用透射電鏡觀察懸液中線粒體純度。下一步，應(yīng)用FlexStationⅡ熒光檢測儀檢測各組大鼠線粒體的鈣容納力，計(jì)算線粒體鈣容納力(mitochondriacalciumcapacity，CRC)值，以此判斷線粒體的膜通透性。<

9、br>　　 結(jié)果：
　　 經(jīng)投射電鏡鑒定，差速離心法分離大鼠肝臟組織線粒體純度較高，形態(tài)基本正常，可以滿足下一步實(shí)驗(yàn)的要求。經(jīng)過FlexStationⅡ熒光檢測儀檢測的線粒體對外源性鈣脈沖的承受力后，可見，1mgNaHS預(yù)處理組大鼠肝臟線粒體可以承受外源性鈣脈沖(10μMCaCl2/min)約7次左右，而I/R組大鼠肝臟線粒體僅可承受3-4次左右。與I/R組相比，NaHS組CRC值極顯著升高(198.63nmol/mg±24.

10、86nmol/mgVS150.685nmol/mg±13.04nmol/mg，P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 差速離心法分離大鼠肝臟組織線粒體純度較高。肝臟缺血1h/再灌注24h后，線粒體的鈣容納力下降，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrialmembranechannelpore，MPTP)敏感性增加，線粒體功能受損。H2S預(yù)處理后，可以穩(wěn)定肝臟I/R損傷后的線粒體膜電位，降低MPTP敏感性，減少線粒體腫

11、脹，保護(hù)線粒體功能，保護(hù)肝臟細(xì)胞。
　　 實(shí)驗(yàn)二，H2S預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制--磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路研究
　　 研究H2S對肝臟I/R后細(xì)胞凋亡水平的影響，探討其保護(hù)機(jī)制是否通過激活細(xì)胞內(nèi)促生存通路--磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinaseB，PI3K/Akt)通路發(fā)揮作用。
　　 研究方法：

12、　　 SD大鼠隨機(jī)分為4組(處理方法同第一部分)。組織液氮速凍后提取蛋白，westernblot法檢測PI3K/Akt通路主要蛋白--Akt，磷酸化的Akt(phosphorylatedAkt，p-Akt)，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-celllymphoma2，Bcl-2)，活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase3)，細(xì)胞色素C(CytochromeC，CytC)。
　　 結(jié)果：
　　 West

13、ernblot結(jié)果顯示，與I/R組相比，NaHS預(yù)處理組Caspase3蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，IPC組Caspase3蛋白表達(dá)無明顯差異；與I/R組相比，IPC組、NaHS組p-Akt蛋白表達(dá)顯著上升(P＜0.05)，IPC組上升更為明顯；與I/R組相比，IPC組、NaHS組Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)；與I/R組相比，NaHS組細(xì)胞胞漿中CytC蛋白表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：

14、r>　　 NaHS預(yù)處理肝臟I/R損傷，激活了Akt通路，使保護(hù)性蛋白p-Akt，Bcl-2表達(dá)量上升，減少了線粒體內(nèi)CytC向細(xì)胞胞漿釋放，減少細(xì)胞凋亡。推測其保護(hù)作用與激活PI3K-Akt通路，抑制內(nèi)源性和外源性凋亡途徑相關(guān)。
　　 總結(jié)：
　　 1、與I/R組相比，NaHS組肝臟細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，組織中GSH含量升高，提示H2S預(yù)處理對肝臟I/R損傷具有保護(hù)作用；
　　 2、與I/R組相比，NaHS組線粒