磁分離酶聯(lián)免疫分析法在日本血吸蟲抗體檢測中的應(yīng)用.pdf

1、日本血吸蟲病在我國主要流行于湖南、湖北、江西、安徽、江蘇、四川和云南等7個疫區(qū)省、市的110個縣。根據(jù)2009年全國血吸蟲病疫情通報,血吸蟲病人365770人,其中晚期血吸蟲病人28820人,急性血吸蟲病人77例,與2008年相比下降了11.42％。目前,我國血吸蟲病流行區(qū)域感染率和感染度均呈現(xiàn)大幅度下降,糞檢在低度流行區(qū)漏檢率高,近年來廣泛采用血清免疫學(xué)診斷方法開展篩查,以提高檢測的敏感性,已取得了較好的效果。
　　雖然檢測循環(huán)

2、抗原既能區(qū)分現(xiàn)在感染與既往感染,又具有一定的療效考核價值,但目前檢測的測試系統(tǒng)特異性較差,尤其對于慢性輕度感染者,循環(huán)抗原檢測的敏感性并不理想。血清抗體檢測因敏感性高,成本低廉,簡便操作,而被廣泛用于日本血吸蟲病的輔助診斷和疫情檢測。血清抗體檢測的診斷抗原主要有粗制的成蟲或蟲卵抗原,純化及重組抗原。基因重組抗原成本低廉,制備簡便,且周期短,方法易于標準化,因此,更適合商品化生產(chǎn)和流行區(qū)血吸蟲病的血清學(xué)輔助診斷。缺少準確、快速、簡便、并且

3、適合基層現(xiàn)場應(yīng)用的血吸蟲病檢測方法已經(jīng)成為目前血吸蟲病防治研究領(lǐng)域的技術(shù)瓶頸,已嚴重阻礙了我國血吸蟲病防治的步伐。
　　磁分離酶聯(lián)免疫技術(shù)(magnetic affinity enzyme-linked immunoassay,MEIA)是由瑞士Serono診斷中心在20世紀80年代中期發(fā)明的一種檢測新技術(shù)。其原理是將磁性分離與酶聯(lián)免疫分析技術(shù)相結(jié)合,以高度均勻的磁性微球作為固相支持物,采用磁性微球液相分離取代傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫酶標板包

4、被法的固相分離,在外加磁場的作用下迅速地分離游離物和結(jié)合物。磁性微球具有顆粒小、表面積大等優(yōu)點,可結(jié)合更多的診斷分子,使蛋白吸附能力超出普通酶標板載體的千倍以上,從而使該方法的敏感性高于以普通酶標板為載體的ELISA方法。而且磁微?？梢岳么判苑蛛x器方便地對所形成的復(fù)合物進行收集分離,使得洗滌結(jié)果更加徹底、干擾物濃度大大降低及靶物質(zhì)濃度有效聚集,進而可提高檢測方法的信噪比和靈敏度。另外,該方法具有操作簡單、使用便捷等特點,因而在免疫學(xué)檢

5、測中具有較好的應(yīng)用前景。
　　本研究制備了日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原及基因重組抗原,并將抗原與磁球偶聯(lián),建立了基于抗原的磁分離酶聯(lián)免疫分析法。并將其用于檢測輕度感染日本血吸蟲病患者血清,治療后血清及肺吸蟲病患者血清,從而為提供一種新的可供選擇的方法用于檢測日本血吸蟲抗體。
　　本論文分為以下三部分:
　　(1)SEA-MEIA方法在日本血吸蟲抗體檢測中的研究
　　本研究利用SEA-MEIA法檢測感染日本血吸蟲血清中

6、的抗體,進而將其與SEA-ELISA結(jié)果相比較。研究發(fā)現(xiàn),SEA-MEIA法與SEA-ELISA法檢測輕度感染日本血吸蟲病患者的敏感性分別是96.55％(56/58)和91.38％(53/58);SEA-ELISA檢測為假陰性的5份陽性血清,其中3份被SEA-MEIA檢測為陽性;經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較分析,SEA-MEIA比SEA-ELISA具有更高的敏感性(χ2=21.95,P<0.01)。經(jīng)非參數(shù)Pearson’s相關(guān)分析,兩種方法檢測日本血

7、吸蟲病患者血清抗體的OD值之間具有顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.845,P<0.01)。SEA-MEIA和SEA-ELISA檢測正常人血清均未出現(xiàn)陽性反應(yīng)(0/30),與肺吸蟲病人的血清出現(xiàn)了交叉反應(yīng)(3/6)。15例輕度感染血吸蟲病患者,經(jīng)吡哇酮治療后半年收集血清,糞檢顯示蟲卵為陰性。SEA-MEIA與SEA-ELISA檢測的抗體轉(zhuǎn)陰率分別為26.67％(4/15)、33.33％(5/15),經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較分析,兩種方法的檢出率具有顯著性差異

8、(χ2=10.909,P<0.01)。結(jié)果提示SEA-MEIA法是一種敏感性高、簡便快速的日本血吸蟲抗體檢測方法。
　　(2)日本血吸蟲抗原基因的載體構(gòu)建、原核表達及抗原性鑒定
　　本研究利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了重組表達載體 pGEX-Sj23突變體,pGEX-Sj23大親水性片段(pGEX-Sj23-LHD),pET28a-Sj23突變體,pET28a-Sj26及pET28a-Sj14-3-3。
　　含有重組質(zhì)粒p

9、GEX-Sj23突變體、pET28a-Sj23突變體的表達菌株,在IPTG的誘導(dǎo)下都未見明顯的重組蛋白表達。含有重組質(zhì)粒pGEX-Sj23-LHD的表達菌株在IPTG的誘導(dǎo)下可見重組蛋白的表達,且表達產(chǎn)物經(jīng)GST免疫親和層析純化,SDS-PAGE電泳顯示該融合蛋白分子量約34kDa,其中包括寄生蟲蛋白LHD約8kDa,載體表達蛋白26kDa。含有重組質(zhì)粒pET28a-Sj26、pET28a-Sj14-3-3的表達菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,表

10、達產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和層析純化,可獲得高純度的重組蛋白。SDS-PAGE電泳顯示該融合蛋白分子量分別約27kDa、31kDa,其中包括6個His-tag,且兩種蛋白都主要以可溶性的形式表達。
　　重組蛋白Sj23-LHD、Sj26、Sj14-3-3可特異性的被感染了日本血吸蟲的兔血清、小鼠血清所識別,而不能被正常兔血清、正常小鼠血清所識別,且重組蛋白Sj23-LHD可被感染了日本血吸蟲3W的小鼠血清所識別。說明純化的重組抗原具有抗原性,

11、可用于后續(xù)的實驗研究。
　　(3)基于重組抗原的MEIA方法在日本血吸蟲抗體檢測中的研究
　　研究發(fā)現(xiàn),rSj26-MEIA和rSj14-3-3-MEIA都可檢測出感染了日本血吸蟲小鼠血清中的抗Sj26及Sj14-3-3的特異性抗體,且rSj26-MEIA與rSj14-3-3-MEIA檢測為陽性血清的平均OD值與陰性血清的平均OD值之比(P/N)均高于ELISA(3.92versus2.66、3.71 versus2.45)

12、。
　　rSj26-MEIA與rSj26-ELISA檢測輕度感染日本血吸蟲病人血清的陽性率均為24.14％(14/58),經(jīng)相關(guān)分析,rSj26-MEIA與rSj26-ELISA檢測的抗體OD值之間存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.658,P<0.01),這兩種方法檢測為陽性血清的平均OD值與陰性血清平均OD值之比(P/N)分別為3.61、2.56。rSj14-3-3-MEIA與rSj14-3-3-ELISA檢測輕度感染日本血吸蟲病人血清的

13、陽性率為22.41％(13/58),經(jīng)相關(guān)分析,rSj14-3-3-MEIA與rSj14-3-3-ELISA檢測的抗體OD值之間存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.618,P<0.01),這兩種方法檢測為陽性血清的平均OD值與陰性血清的平均OD值之比(P/N)分別為3.65、2.71。經(jīng)統(tǒng)計比較分析,rSj26-MEIA與rSj14-3-3-MEIA的陽性檢出率之間沒有顯著性差異(χ2=3.198,P>0.05)。
　　檢測治療后半年且糞檢顯

14、示蟲卵為陰性的血清,rSj26-MEIA與rSj26-ELISA的陽性檢出率均為13.33％(2/15);rSj14-3-3-MEIA與rSj14-3-3-ELISA均沒有檢出陽性反應(yīng)(0/15)。基于這兩種抗原的MEIA和ELISA檢測肺吸蟲病人血清(0/6)、正常人血清均未出現(xiàn)陽性反應(yīng)(0/30)。
　　上述結(jié)果顯示,基于rSj26和rSj14-3-3的MEIA法與ELISA法檢測輕度感染日本血吸蟲病具有相似的敏感性,rSj2