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文檔簡(jiǎn)介
1、糖尿病是一種代謝性疾病,它的主要特點(diǎn)是高血糖。糖尿病患者長(zhǎng)期存在高血糖,會(huì)使各種組織器官,尤其是眼、腎臟、心臟、血管、神經(jīng)等功能的慢性損害。桑葉具有良好的治療糖尿病效果,我國(guó)是產(chǎn)桑大國(guó),桑葉中提取的提取物質(zhì),如總多糖,黃酮和生物堿的抗血糖功能被廣泛的研究,而桑葉也常與其他中藥配伍治療糖尿病。
PPARγ是核受體超家族成員,PPARγ激活后通過(guò)相關(guān)調(diào)節(jié)可以促進(jìn)脂聯(lián)素分泌,增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性。通過(guò)PPARγ信號(hào)通路,改善胰島
2、素抵抗,是目前人們研究抗糖藥物的一種有效途徑。PPARγ與激活劑結(jié)合后被激活,會(huì)和RXR形成異源二聚體,與靶基因啟動(dòng)子上游的反應(yīng)元件PPRE結(jié)合,調(diào)控?zé)晒馑孛笀?bào)告基因的表達(dá)水平。本研究利用這個(gè)原理,旨在建立一種簡(jiǎn)單、高效、靈敏的高通量篩選PPA Rγ配體的Cos-7細(xì)胞模型,并運(yùn)用于桑葉中的小分子活性物質(zhì)的篩選。
本研究構(gòu)建重組表達(dá)載體pEGFP-N2-PPARγ,pGL4-PPRE4-1uc。利用lipofectamine2
3、000,采用共轉(zhuǎn)染的方式將兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞,并對(duì)細(xì)胞模型進(jìn)行優(yōu)化處理,最終選定細(xì)胞匯合度為70%,pEGFP-N2-PPARγ與pGL4-PPRE4-1uc的質(zhì)粒濃度比為2∶1,轉(zhuǎn)染時(shí)間為20 h,藥物孵育時(shí)間為24 h。利用PPARγ陽(yáng)性配體羅格列酮檢測(cè)模型的穩(wěn)定性和特異性,結(jié)果顯示模型的穩(wěn)定性良好,且僅對(duì)羅格列酮有激活效應(yīng)并在一定范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系,而對(duì)其他配體沒(méi)有激活效應(yīng)。通過(guò)以上驗(yàn)證證明PPARγ配體高通量篩選細(xì)胞模型已經(jīng)成構(gòu)
4、建,可用于桑葉中小分子活性物質(zhì)的初步篩選。
本研究利用正己烷粗提桑葉中的有效成分,運(yùn)用硅膠柱層析和薄層層析初步分離正己烷初提物,得到Fr.PE-1到Fr.PE-40四十個(gè)分離樣品。利用Cos-7細(xì)胞模型,檢測(cè)40個(gè)組分的活性,發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)組分活性較好。將6個(gè)組分進(jìn)行堿法衍生,并用GC-MS分析組分的脂肪酸構(gòu)成。通過(guò)檢測(cè),我們共從桑葉中獲得18種脂肪酸。將脂肪酸用Cos-7細(xì)胞模型分析,結(jié)果顯示十四酸,十五酸,亞麻酸均有PPAR
5、γ激活作用,其他脂肪酸均無(wú)作用。其中當(dāng)十四酸的濃度為100μmol/L、十五酸濃度為50μmol/L、亞麻酸濃度為150μmol/L、亞油酸濃度為100Ⅲmol/L時(shí),其激活倍數(shù)達(dá)到最大,分別為1.51倍、2.12倍、2.48倍和2.21倍。利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),發(fā)現(xiàn)干燥桑葉中亞麻酸占1.91%,亞油酸占0.94%,十四酸占0.11%。
桑葉中的PPARγ活性激動(dòng)劑的分離和篩選為尋找新的天然的胰島素增敏劑,合成新型PPARγ
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