SPR生物傳感器用于胰島素樣生長因子-1受體信號通路蛋白相互作用研究.pdf

1、表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)生物傳感器技術(shù)因其實時、快速、無需標記的特點已廣泛用于研究生物分子之間相互作用的動力學(xué)過程。本文采用SPR生物傳感器技術(shù)研究胰島素樣生長因子-1受體上游蛋白相互作用，研究內(nèi)容包括：胰島素受體底物(insulin receptor substrate-1，IRS-1)和磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3-K

2、)與磷酸化或非磷酸化胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor receptor-1，IGF-1R)的結(jié)合解離動力學(xué)；Mg2+、Mn2+、ATP、激酶抑制劑染料木黃酮和槲皮素存在時，IRS-1和PI3-K與IGF-1R的相互作用變化；來源于IGF-1R的磷酸化多肽(IGF-1R多肽)對IRS-1/IGF-1R結(jié)合影響，并探討了IRS-1對PI3-K與IGF-1R直接結(jié)合的影響以及三者結(jié)合模型；建立基于

3、SPR傳感芯片表面的IGF-1R多肽的磷酸化-去磷酸化開關(guān)技術(shù)平臺，應(yīng)用此技術(shù)平臺研究IGF-1R多肽與下游蛋白相互作用和酪氨酸激酶反應(yīng)。論文工作得到以下結(jié)果：
　　 1.固定于CM5芯片表面的抗IGF-1Rα亞基單克隆抗體特異性地捕獲了過表達IGF-1R細胞裂解液中的IGF-1R，此捕獲的受體成功地用于與IRS-1和PI3-K的相互作用研究。
　　 2.IGF-1R受體磷酸化提高了其與IRS-1結(jié)合速率，引起IGF-1

4、R/IRS-1親和力增強10.8倍，Mg2+、Mn2+進一步提高了IRS-1與磷酸化IGF-1R的結(jié)合解離速率。激酶抑制劑染料木黃酮和槲皮素表現(xiàn)出與ATP相同的影響趨勢，分別使親和常數(shù)下降6.0、6.6和4.7倍。IGF-1R磷酸化多肽競爭性抑制IRS-1與IGF-1R的結(jié)合。
　　 3.PI3-K和IGF-1R可以直接結(jié)合，較之于非磷酸化受體，磷酸化的IGF-1R與PI3-K的親和常數(shù)增強了20.5倍，Mg2+進一步提高了PI

5、3-K與磷酸化IGF-1R的結(jié)合速率。ATP存在下兩者的親和力不變，但結(jié)合與解離速率常數(shù)都有所提高。激酶抑制劑染料木黃酮和槲皮素與ATP表現(xiàn)出不同的趨勢，兩者使PI3-K/IGF-1R的結(jié)合速率降低。通過PI3-K、IRS-1和抑制IRS-1與IGF-1R直接結(jié)合的IGF-1R多肽共孵育來研究IRS-1對PI3-K和IGF-1R結(jié)合的影響，IRS-1促進了PI3-K與IGF-1R的結(jié)合，表明三個蛋白質(zhì)間兩兩之間可能都有相互作用。

6、　　 4.在激酶反應(yīng)條件下，過表達IGF-1R的細胞裂解液使芯片表面的非磷酸化模擬受體多肽磷酸化，表現(xiàn)出一定的受體酪氨酸激酶-底物特異性、酪氨酸磷酸化水平-孵育時間依賴性、磷酸化水平檢測的抗體濃度依賴性、激酶抑制劑對磷酸化抑制的濃度依賴性。固相磷酸化多肽可用于與IRS-1相互結(jié)合研究。磷酸化多肽表面能被白細胞特異性抗原酪氨酸磷酸酶完全去磷酸化，且1 mM的磷酸酶抑制劑正釩酸鈉可抑制此去磷酸化過程，實現(xiàn)了傳感芯片表面的磷酸化-去磷酸開關(guān)