甲狀腺激素受體α1與類胰島素生長因子結(jié)合蛋白6相互作用及其成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié).pdf

1、類胰島素生長因子結(jié)合蛋白6（IGFBP-6）是類胰島素生長因子（IGF）結(jié)合蛋白家族成員，在細(xì)胞生長過程中具有依賴或不依賴IGF的活性。IGFBP-6通過抑制IGF-Ⅱ的作用直接抑制腫瘤的發(fā)生，但是在一些情況中，IGFBP-6卻與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)，這顯然不是IGF-Ⅱ抑制的結(jié)果。IGFBP-6的這一矛盾作用的分子機(jī)制至今不清楚。在之前的研究中，其他研究者和我們都已經(jīng)證明IGFBP-6具有進(jìn)入細(xì)胞核的性質(zhì)。但是IGFBP-6在細(xì)胞核內(nèi)

2、的作用所知甚少。甲狀腺激素(TH)在個(gè)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞增殖和分化方面均有廣泛的作用。TH結(jié)合甲狀腺激素受體(TR)，包括TRα和TRβ。TR屬于核激素受體超家族，調(diào)節(jié)正向和負(fù)向基因轉(zhuǎn)錄。在缺少配體時(shí)，TR結(jié)合特異DNA序列，通過和共抑制子相互作用主動(dòng)抑制轉(zhuǎn)錄。配體的結(jié)合導(dǎo)致TR結(jié)構(gòu)改變，釋放共抑制子并招募共激活子而激活轉(zhuǎn)錄。甲狀腺激素調(diào)節(jié)骨細(xì)胞分化，可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化使細(xì)胞周期停止在G0/G1期并促進(jìn)骨基質(zhì)蛋白表達(dá)。IGF

3、BP-6在骨生長和成骨細(xì)胞中的功能還不清楚。
　　 本研究通過GST-pulldown實(shí)驗(yàn)證明IGFBP-6可以在體外直接結(jié)合甲狀腺激素受體α1(TRα1)和維甲酸X受體α(RXRα)，干擾TRα1與RXRα異二聚體的形成。IGFBP-6可以在體外直接結(jié)合TRα1DBD和LBD。IGFBP-6的C端結(jié)構(gòu)域是與TRα1作用的主要結(jié)構(gòu)域，IGFBP-6的N端結(jié)構(gòu)域也參與作用。突變IGFBP-6的LXXLL模體不影響與TRα1的相互作

4、用。通過細(xì)胞免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察到TRα1和IGFBP-6可以共定位于HEK-293，MG-63和Hela細(xì)胞。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明在全細(xì)胞裂解液和細(xì)胞核抽提物中，過表達(dá)TRα1和IGFBP-6的HEK-293細(xì)胞中存在兩蛋白的相互作用。通過FRET實(shí)驗(yàn)證明在HEK-293細(xì)胞中TRα1和IGFBP-6兩蛋白之間有能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，說明在細(xì)胞內(nèi)兩蛋白可以相互作用。通過雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)證明結(jié)合了T3的TR作用于生長激素啟動(dòng)子，因此刺激含T

5、RE的啟動(dòng)子的基因表達(dá)，但過表達(dá)IGFBP-6則明顯抑制這一作用，并且隨著IGFBP-6轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量的增加抑制作用增強(qiáng)。通過real-timeqRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明T3增加成骨細(xì)胞骨鈣素的mRNA，但過表達(dá)的IGFBP-6可以抑制這一作用。通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測U20S細(xì)胞周期，IGFBP-6減弱由T3引起的G0/G1期停止作用。通過real-timeqRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明在T3作用下，過表達(dá)IGFBP-6抑制HEK-293細(xì)胞中cycli