脂聯(lián)素在小鼠急性肝損傷的表達(dá)及作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本文采用ConA誘導(dǎo)小鼠制造急性肝損傷模型，應(yīng)用脂聯(lián)素干預(yù)實(shí)驗(yàn)全面、系統(tǒng)地探討了脂聯(lián)素對(duì)急性肝損傷的保護(hù)機(jī)制，包括脂聯(lián)素對(duì)TNF-α、白介素-10(interleukin-10，IL-10)等多種炎癥細(xì)胞因子的影響：脂聯(lián)素對(duì)肝細(xì)聯(lián)素是機(jī)體產(chǎn)生的一種生理性的脂肪因子，研究脂聯(lián)素對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用，可為脂聯(lián)素應(yīng)用于肝炎的臨床治療提供理論依據(jù)，為病毒性肝炎等肝損傷的治療提供一條安全、有效的新途徑。 方法: 1. 急性

2、肝損傷模型的建立及脂聯(lián)素的表達(dá) 健康雄性BALB/c小鼠21只，4周齡，體重20±3g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)一周后，用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為3組。ConA組8只：ConA 30mg/kg尾靜脈注射。對(duì)照組8只：尾靜脈注射生理鹽水10ml/kg。脂聯(lián)素組5只：在靜脈注射ConA前12小時(shí)和2小時(shí)前，分別應(yīng)用脂聯(lián)素3mg/kg腹膜內(nèi)注射(其余兩組同時(shí)給與相當(dāng)毫升的生理鹽水腹膜內(nèi)注射)。實(shí)驗(yàn)小鼠在注射ConA前12

3、小時(shí)開(kāi)始禁食。 注射ConA后8小時(shí)股動(dòng)脈放血處死小鼠，離心血液留取血清，-20℃冰箱保存，用于血清學(xué)檢測(cè)；取部分肝組織立即10％的福爾馬林固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明浸蠟后，將標(biāo)本石蠟包埋制成蠟塊后聯(lián)續(xù)切片，用于免疫組化檢測(cè)或常規(guī)蘇木素.伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，進(jìn)行普通病理學(xué)觀察；部分肝組織液氮冷凍，存于-80℃冰箱用于mRNA檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(enzyme linked immun

4、osorbent assay。ELISA)檢測(cè)血清脂聯(lián)素水平；采用免疫組化法檢測(cè)肝組織脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)肝組織脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)。 2. 脂聯(lián)素對(duì)Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用 脂聯(lián)素干預(yù)模型的建立和標(biāo)本的制備同第一部分。本研究檢測(cè)了各組小鼠細(xì)胞因子的血清水平及部分細(xì)

5、胞因子mRNA在肝組織的表達(dá)。采用速率法測(cè)定各組小鼠ALT的血清水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)檢測(cè)各組小鼠血清TNF-α、IL-10、IL-4、INF-γ的水平。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)肝組織TNF-αmRNA、IL-10 mRNA表達(dá)。 3. 脂聯(lián)素對(duì)急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響 脂聯(lián)素干預(yù)模型的建立和標(biāo)本的制備同第一部分。脂聯(lián)素對(duì)ConA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡是促進(jìn)還是抑制?本文采用TdT介導(dǎo)的脫氧核苷酸

6、切口末端標(biāo)記法(TdT-mediated x-dUTP nick end labeling，TUNEL)原位檢測(cè)各組小鼠肝細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征和分布，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖周期。 4. 脂聯(lián)素抗炎作用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的初步探討 脂聯(lián)素干預(yù)模型的建立和標(biāo)本的制備同第一部分。脂聯(lián)素發(fā)揮抗炎作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制目前尚不明確，本文采用免疫組化法檢測(cè)了各組小鼠肝組織cAMP依賴的蛋白

7、激酶(cAMP-dependent protein kinase，PKA)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)蛋白的表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)肝組織PKA mRNA和P13K mRNA表達(dá)；NF-κB活性的檢測(cè)采用凝膠電泳遷移率改變分析法(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)。 結(jié)果: 1. 急性肝損傷模型的建立及脂聯(lián)

8、素的表達(dá) ①普通病理觀察光鏡下，對(duì)照組小鼠肝組織無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。ConA組可見(jiàn)肝內(nèi)大量T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，在匯管區(qū)尤為明顯，肝竇內(nèi)紅細(xì)胞淤積，中央靜脈周圍肝細(xì)胞水腫明顯，可見(jiàn)點(diǎn)、灶狀壞死區(qū)。脂聯(lián)素組肝組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，無(wú)明顯淤血，肝細(xì)胞輕度水腫。②血清脂聯(lián)素的檢測(cè)結(jié)果：脂聯(lián)素組血漿脂聯(lián)素水平(15.4±3.0μg/ml)與對(duì)照組(16.5±2.8μg/ml)比較無(wú)差異(P>0.05)，與ConA組(11.8±2.1μg/ml

9、)比較明顯升高(P<0.05)。ConA組與對(duì)照組比較顯著降低(P<0.05)。③肝組織脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)：對(duì)照組小鼠肝組織脂聯(lián)素蛋白少量表達(dá)在中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。ConA組肝組織脂聯(lián)素蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，尤以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)為著。脂聯(lián)素組表達(dá)輕度增強(qiáng)，見(jiàn)于炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)及部分肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)分析顯示：脂聯(lián)素組脂聯(lián)素蛋白表達(dá)(5.39±1.72％)與對(duì)照組(1.82±0.36％)比較表達(dá)增強(qiáng)(p<0.05)，與ConA組(10.63±4.35

10、％)比較表達(dá)下降(p<0.01)；ConA組脂聯(lián)素蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較明顯增強(qiáng)(p<0.01)。④肝組織脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)：對(duì)照組小鼠肝組織即可檢測(cè)到少量脂聯(lián)素tuRNA表達(dá)，脂聯(lián)素組和ConA組表達(dá)均增強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)分析示：脂聯(lián)素組脂聯(lián)素mRNA表達(dá)(0.46±0.17)與對(duì)照組(0.23±0.05)比較表達(dá)增強(qiáng)(p<0.05)，與ConA組(0.51±0.21)比較表達(dá)無(wú)差異(p>0.05)；ConA組脂聯(lián)素mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較明顯

11、增強(qiáng)(p<0.01)。 2. 脂聯(lián)素對(duì)Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用 ①各組小鼠血清ALT水平：對(duì)照組血清ALT水平(44.71±21.29U/L)最低，其次為脂聯(lián)素組(192.50±45.87U/L)，Con A組ALT水平最高(616.00±171.50 U/L)；統(tǒng)計(jì)分析示：脂聯(lián)素組血清ALT水平與對(duì)照組比較明顯升高(p<0.05)，與ConA組比較明顯下降(p<0.01)；ConA組與對(duì)照組比較明顯

12、升高(p<0.01)。②各組小鼠血清TNF-α、IL-10、IL-4、INF-γ的變化：對(duì)照組、脂聯(lián)素組和Con A組血清TNF-α水平分別為：0.06±0.04 ng/ml，0.51±0.29 ng/ml，0.92±0.37 ng/ml；IL-10血清水平分別為：O.09±0.06 ng/ml，0.54±0.17 ng/ml，0.26±0.11 ng/ml；IL-4血清水平分別為0.08±0.03 ng/ml，0.27±0.11 ng

13、/ml，0.69±0.25 ng/ml；INF-γ血清水平分別為：0.71±0.28 ng/ml，2.24±0.46 ng/ml，2.97±0.61 ng/ml；對(duì)照組4種細(xì)胞因子水平均低于脂聯(lián)素組和ConA組，脂聯(lián)素組IL-10血清水平高于Con A組(p<0.05)，其余3種細(xì)胞因子均低于Con A組。⑧相關(guān)分析顯示：血清ALT水平分別與血清TNF-α、IL-4、INF-γ水平呈正相關(guān)(r：0.738p<0.01；r：0.693 p

14、<0.01；r：0.637 p<0.01)。④肝組織TNF-α mRNA的表達(dá)：對(duì)照組微量表達(dá)(0.13±0.07)，Con A組表達(dá)(0.82±0.27)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(p<0.01)，脂聯(lián)素組表達(dá)(0.51±0.19)較對(duì)照組增強(qiáng)(p<0.01)；脂聯(lián)素組較Con A組表達(dá)下降(p<0.05)⑤肝組織IL-10 mRNA的表達(dá)：對(duì)照組微量表達(dá)(0.21±0.11)，脂聯(lián)素組(0.74±0.27)較對(duì)照組表達(dá)明顯增強(qiáng)(p<0.01)

15、；Con A組(0.43±0.19)較對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)(p<0.05)，脂聯(lián)素組較Con A組表達(dá)增強(qiáng)(p<0.05)。 3. 脂聯(lián)素對(duì)急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響 4 脂聯(lián)素抗炎作用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的初步探討 結(jié)論: 1.小鼠靜脈注射ConA可導(dǎo)致肝臟急性炎癥，血清脂聯(lián)素水平降低，這與注射ConA后產(chǎn)生的大量炎癥細(xì)胞因子抑制脂肪組織分泌脂聯(lián)素有關(guān)。但肝組織脂聯(lián)素蛋白及其mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，這與肝組織內(nèi)炎癥

16、細(xì)胞的浸潤(rùn)及機(jī)體所產(chǎn)生的抗炎機(jī)制有關(guān)。如靜脈注射ConA前補(bǔ)充外源性脂聯(lián)素，可明顯減輕炎癥，表明脂聯(lián)素可減輕ConA誘導(dǎo)的肝組織炎癥程度，但對(duì)其mRNA在肝組織的表達(dá)無(wú)明顯影響。 2. 小鼠靜脈注射ConA可升高血清ALT以及IL-4、TNF-α、IL-10和IFN-γ多種細(xì)胞因子血清水平。預(yù)先應(yīng)用重組脂聯(lián)素干預(yù)可降低ALT血清水平以及促炎細(xì)胞因子IL-4、TNF-α和IFN-γ的血清水平，但升高抗炎因子IL-10的血清水平及其

17、在肝臟的表達(dá)，即脂聯(lián)素通過(guò)促進(jìn)抗炎因子、抑制促炎因子的產(chǎn)生來(lái)降低升高的血清ALT水平。 3. 注射ConA可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡并抑制肝細(xì)胞再生。脂聯(lián)素可改善ConA對(duì)肝細(xì)胞增殖的抑制作用并明顯降低肝細(xì)胞的凋亡率，從而起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用。 4. 注射ConA后小鼠肝組織P13K和PKA蛋白表達(dá)以及NF-κB的結(jié)合活性增強(qiáng)，補(bǔ)充外源性脂聯(lián)素可進(jìn)一步增強(qiáng)P13K的蛋白及mRNA的表達(dá)，降低NF-κB的活性，而PKA表達(dá)無(wú)變化