褪黑激素對HeLa細(xì)胞的抗增殖活性及相關(guān)作用的實驗研究.pdf

1、褪黑激素(MT)是生物體內(nèi)普遍存在的一種吲哚類激素，在人體內(nèi)主要由松果體合成和分泌。MT具有提高機(jī)體免疫功能、抗氧化作用及抗腫瘤活性等重要的生理及藥理作用，且相對安全。因此，MT的功能研究是目前國內(nèi)外研究熱點之一。 MT的腫瘤化學(xué)預(yù)防、抗腫瘤活性及其應(yīng)用前景，已引起人們的關(guān)注。中、晚期宮頸癌的死亡率仍居高不下。宮頸癌手術(shù)治療之后必須進(jìn)行化療。研究表明，宮頸癌患者血漿中MT水平較正常人低。因此，推測MT可能有助于宮頸癌的治療。

2、 本工作采用體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系HeLa細(xì)胞等及動物移植性腫瘤模型，觀察MT對腫瘤的抑制情況，以進(jìn)一步明確MT的抗腫瘤活性。運用Western Blotting法觀察MT對HeLa細(xì)胞內(nèi)NF-кB的含量變化及其調(diào)控蛋白的調(diào)控情況，以證實NF-кB的含量及活性變化與MT抗腫瘤活性的關(guān)系。進(jìn)一步分析MT對HeLa細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，MT對HeLa細(xì)胞形態(tài)的影響，HeLa細(xì)胞運用MT后胞內(nèi)抗氧化能力的變化以及MT1及MT2褪黑激素膜受體在

3、。HeLa細(xì)胞上的表達(dá)。 通過上述研究，有助于評價MT的抗腫瘤活性及其相關(guān)作用，為在腫瘤的綜合治療中提供一種具多種治療效應(yīng)且毒性相對小的腫瘤治療或輔助治療用藥，提供重要的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 1．褪黑激素的體內(nèi)外抗腫瘤活性研究 從HL60、B16、HeLa及MCF-7的生長曲線中可見，隨著MT劑量的增加，作用時間的延長，它對腫瘤細(xì)胞的抑制增殖活性明顯增強(qiáng)，生長曲線也隨之下移。MT作用72小時，HeLa的IC<,5

4、0>為61.71μg/mL，與其余三種細(xì)胞系比較，HeLa細(xì)胞的IC<,50>最小。結(jié)果進(jìn)一步證實MT可抑制體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的增殖。 MT組、MT+CTX組及MT+5-FU組較對照組、CTX組及5-FU組在實驗結(jié)束時體重均值有所增加，結(jié)果顯示，MT沒有明顯的毒性反應(yīng)。單用MT80mg/kg在不產(chǎn)生明顯毒性反應(yīng)基礎(chǔ)上，對小鼠實體瘤U14的生長有一定的抑制作用，最大抑瘤率為30.9％。MT+CTX聯(lián)用(q=1.072)及MT+5-FU聯(lián)用(

5、q=1.093)均可產(chǎn)生單純相加作用。結(jié)果提示，MT可在不產(chǎn)生毒性反應(yīng)的基礎(chǔ)上抑制小鼠實體瘤U14的生長，與CTX聯(lián)用、5-FU聯(lián)用均可增強(qiáng)抑瘤作用。 2．褪黑激素對HeLa細(xì)胞NFкB及其相關(guān)蛋白IкKα/β、IкB-α及p-IкB-α水平的影響 Western blowing分析顯示，MT 0.2μg/μL作用1d、2d及3d，MT作用2d后對HeLa細(xì)胞NFкB水平的抑制作用呈時間依賴性下調(diào)，IкB-α水平呈時間依

6、賴性上調(diào)，p-IкB-α水平則呈時間依賴性下調(diào)，而IкKα/β水平也呈時間依賴性下調(diào)。MT 0.008μg/μL，0.04μg/μL及0.2μg/μL作用3d，對HeLA細(xì)胞NFкB的抑制作用呈明顯的濃度依賴性；p-IкB-α水平呈濃度依賴性下調(diào)，從MT0.04μg/μL開始，IкKα/β水平呈濃度依賴性下調(diào)而IкB-α水平呈濃度依賴性上調(diào)。結(jié)果提示，MT對HeLA細(xì)胞NFкB蛋白的抑制作用呈濃度依賴性及時間依賴性。結(jié)果還表明，MT可能

7、通過直接或間接抑制IкKαβ而使IкB-α蛋白降解減少，水平上調(diào)，p-IкB-α蛋白水平下調(diào)，可能導(dǎo)致IкB-α對NFαB抑制增加，使NFкB活性降低。說明MT在產(chǎn)生抗增殖活性劑量下能下調(diào)NFкB水平；而且NFкB活性可能也因調(diào)控蛋白IкKα/β水平下調(diào)，IкB-α水平上調(diào)及p-IкB-α水平下調(diào)而受到抑制。 3 褪黑激素對HeLa細(xì)胞抑制增殖活性的其余相關(guān)作用 熒光顯微鏡下，未經(jīng)MT處理的經(jīng)胰酶消化的HeLa細(xì)胞呈圓形

8、；MT 1μg/μL作用24h、48h及72h，胞膜溶解的壞死細(xì)胞隨作用時間的延長而逐漸增多，凋亡細(xì)胞少見。由此可見，MT主要致HeLa細(xì)胞壞死而少致凋亡。 電鏡下，未經(jīng)MT處理的對照組細(xì)胞，異染色質(zhì)少，常染色體多；MT組0.2μg/μL作用72h，可見胞膜不完整的壞死細(xì)胞及少量胞膜完整、染色質(zhì)聚集在核膜的周邊的凋亡細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測顯示，MT 0.008μg/μL、0.04μg/μL及0.2μg/μL作用72h后，S期細(xì)胞比

9、例隨劑量增加而逐漸降低。結(jié)果提示，MT可能抑制HeLa細(xì)胞的S期。 HeLa細(xì)胞的總抗氧化能力及總SOD、GSH的水平測定顯示：MT作用于。HeLa細(xì)胞1d、2d及3d，低劑量MT組、中劑量MT組、高劑量MT組及極高劑量MT組的T-AOC均數(shù)分別與對照組比較，均有增加。隨著MT濃度的增加，作用時間的延長，T-AOC逐漸增強(qiáng)，以1μg/μL MT作用3d為最明顯；T-SOD均數(shù)均有所增加，GSH含量均數(shù)也有所增加，但均不存在明顯的

10、時間與劑量依賴性。 Western blotting法及免疫組織化學(xué)法結(jié)果提示，HeLa細(xì)胞上未能檢測到MT1及MT2受體，MT抑制HeLa細(xì)胞的增殖活性可能與激動MT膜受體無關(guān)，但核受體ROR/RZR的激動作用是否存在，有待證實。 這些結(jié)果提示，MT在抑制HeLa細(xì)胞增殖的劑量下引起細(xì)胞形態(tài)的改變主要以壞死為主，還能抑制細(xì)胞周期的S期，并且提高HeLa細(xì)胞的T-AOC，其中T-SOD及GSH水平提高。 綜上所述

11、，本工作提示： 1．褪黑激素對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞HeLa、MCF-7、HL60及B16均有抑制增殖活性，其中對HeLa細(xì)胞的抑制作用最顯著，抑制濃度范圍在0.008μg/μL～1μg/μL。MT對HeLa細(xì)胞的IC<,50>為0.617μg/μL。 2．褪黑激素對小鼠移植性腫瘤U14有一定的抑制作用，MT 80mg/kg對U14的抑瘤率達(dá)30.9％；與5-FU、CTX合用可能有協(xié)同抑制增殖作用。 3．首次證實褪黑

12、激素對HeLa細(xì)胞的抑制增殖活性可能與下調(diào)NFкB水平有關(guān)，而且存在一定的劑量依賴性與時間依賴性。這可能與MT的抗增殖機(jī)制有關(guān)。 4．首次證實褪黑激素可能通過直接或間接抑制IкKα/β而使IкB-α蛋白降解減少，含量增多，p-IкB-α蛋白因而水平降低，從而可能導(dǎo)致IкB-α對NFкB抑制增加，使NFкB活性降低。這可能與MT的抗增殖機(jī)制有關(guān)。 5．褪黑激素抑制HeLa細(xì)胞增殖活性可能與增強(qiáng)HeLa細(xì)胞的抗氧化能力有關(guān)。