IKCa1相關(guān)的miRNA對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲作用機(jī)制初探.pdf

1、目的：1.探討中電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道(IKCal)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲特性的影響;2.探究IKCal對(duì)miRNA表達(dá)譜的影響，篩選出與IKCal相關(guān)的miRNA，并通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其靶基因，對(duì)其靶基因進(jìn)行功能分析（GO分析），篩選出差異顯著的miRNA，，對(duì)其靶基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，初步探索IKCal相關(guān)miRNA與HeLa細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的相關(guān)關(guān)系，為進(jìn)一步探究miRNA在預(yù)防和治療宮頸癌的靶標(biāo)分子中提供了線索。<

2、br>　　方法：1.分別設(shè)置濃度為0、10.0、20.0、30.0、40.0μmol/L TRAM-34（IKCal特異性阻斷劑）為觀察1-5組及等體積的DMSO組（TRAM-34溶劑）處理HeLa細(xì)胞24h、48h和72h，采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞增殖特性;采用劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)量HeLa細(xì)胞實(shí)際遷移距離從而檢測(cè)HeLa細(xì)胞遷移特性;2.按上述6組分組處理HeLa細(xì)胞48小時(shí)后用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其侵襲特性;3.通過本研究前期

3、預(yù)實(shí)驗(yàn)、查閱相關(guān)文獻(xiàn)、結(jié)合CCK8實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選0.0、30.0μmol/L TRAM-34分別處理HeLa細(xì)胞48小時(shí)作為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，采用高通量測(cè)序方法檢測(cè)IKCal阻斷前、后miRNA表達(dá)譜的變化;4.采用qRT-PCR法對(duì)部分差異顯著表達(dá)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，從而驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性;5.運(yùn)用miRanda、miRWalK、Targetscan、DIANAmT、miRDB等軟件預(yù)測(cè)篩選的差異顯著表達(dá)miRNA可能

4、調(diào)控的靶基因以及GO功能分析;再從表達(dá)譜中上調(diào)和下調(diào)的miRNA中各選一個(gè)與宮頸癌密切相關(guān)的miRNA作為研究對(duì)象即為靶miRNA，對(duì)其靶基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。
　　結(jié)果：1.CCK8實(shí)驗(yàn)提示TRAM-34抑制HeLa細(xì)胞的增殖，在一定范圍內(nèi)，具有劑量依賴性，在培養(yǎng)細(xì)胞24h時(shí)DMSO組、觀察1組和觀察2組三組間差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，其余各組與DMSO組及與觀察1組之間具有顯著性差異(p＜0.001);而培養(yǎng)

5、HeLa細(xì)胞48、72h后，DMSO與觀察1組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，而其余各觀察組與觀察1組、DMSO組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)，提示本實(shí)驗(yàn)中MDSO濃度對(duì)HeLa細(xì)胞無影響;劃痕實(shí)驗(yàn)提示TRAM-34能抑制HeLa細(xì)胞遷移，在一定范圍內(nèi)，具有時(shí)間及劑量依賴性，隨著濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制遷移作用越明顯(p＜0.001))。2.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證明，在一定濃度范圍內(nèi)，HeLa細(xì)胞的侵襲率

6、隨TRAM-34濃度增加呈遞減趨勢(shì)(F=384.050，p＜0.001)。3.分析對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的miRNA高通量測(cè)序結(jié)果，通過對(duì)不同樣本的Clear data的比較，分析其共有序列及特有的序列，以Fold Change≧1.5，qvalue＜0.01為差異顯著表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，在871條差異表達(dá)中篩選出20個(gè)差異顯著表達(dá)的miRNAs，其中15個(gè)差異miRNA表達(dá)上調(diào)，5個(gè)差異miRNA表達(dá)下調(diào)。4.結(jié)合高通量測(cè)序結(jié)果及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，在

7、15個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNA中挑選4個(gè)(hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3P、hsa-miR-223-3P)和5個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA中挑選1個(gè)(hsa-miR-421)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3、hsa-miR-421表達(dá)量的變化趨勢(shì)與高通量測(cè)序的結(jié)果一致，在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

8、.05)，從而檢測(cè)高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性;5.通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，差異顯著的miRNA的靶基因主要富集蛋白結(jié)合，細(xì)胞代謝過程、運(yùn)輸過程等條目;其中hsa-miR-143-5P、hsa-miR-421與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。通過對(duì)hsa-miR-143-5P、hsa-miR-421進(jìn)一步行信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-143--5P靶基因主要涉及到腫瘤蛋白多糖、p53信號(hào)通路、癌癥相關(guān)通路及MAPK信號(hào)通路等過程，其中在p