殼聚糖納米包裹強(qiáng)化IL-2與Tp92核酸疫苗聯(lián)合免疫的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)基因DNA疫苗與梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)Tp92抗原編碼基因DNA疫苗用殼聚糖納米顆粒(chitosan nanoparticles,CS)包裹聯(lián)合免疫新西蘭兔后免疫應(yīng)答效應(yīng)以及對(duì)新西蘭兔的感染后的保護(hù)作用。
　　方法:定向克隆構(gòu)建真核表達(dá)重組體 pcDNA3.1(+)/Tp92和pcDNA3.1(+)/IL-2;用CS納米顆粒包裹后肌

2、肉多點(diǎn)注射聯(lián)合免疫新西蘭兔,每隔2w加強(qiáng)一次共3次,并于初次免疫后第8w每組隨機(jī)取3只兔無(wú)菌分離脾細(xì)胞培養(yǎng), MTT法檢測(cè)兔脾淋巴細(xì)胞增殖水平,ELISA試劑盒檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-2及IFN-γ誘導(dǎo)水平;第10w各實(shí)驗(yàn)組兔皮下接種TpNichols標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行皮膚感染實(shí)驗(yàn),觀察記錄感染早期各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組皮損的變化情況,在免疫及感染期間不同時(shí)間點(diǎn)分別采用ELISA檢測(cè)免疫兔特異性Tp92抗體產(chǎn)生水平,MTT法檢測(cè)兔脾淋巴細(xì)胞增殖水平。

3、同時(shí)在感染后0-48d期間每隔3d觀察記錄感染部位皮損Tp陽(yáng)性率及潰瘍病灶發(fā)生率。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/Tp92和pcDNA3.1(+)/IL-2經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)插入片段為目的基因,測(cè)序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致;均能在HeLa細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)靶蛋白。
　　2. pcD/IL-2基因佐劑的聯(lián)合使用對(duì)pcD/Tp92疫苗在兔體內(nèi)誘生Tp92特異性抗體有顯著促進(jìn)作用(

4、P<0.05);CS對(duì)pcD/Tp92疫苗的包裹對(duì)誘生Tp92特異性抗體有顯著促進(jìn)作用(P>0.05)。
　　3.pcD/IL-2基因佐劑的聯(lián)合使用對(duì)pcD/Tp92疫苗在兔體內(nèi)促進(jìn)IL-2及IFN-γ分泌有著顯著的加強(qiáng)作用(P<0.05);CS納米顆粒對(duì)pcD/Tp92疫苗的包裹并未能顯著促進(jìn)IL-2及IFN-γ的分泌(P>0.05)。
　　4. pcD/IL-2基因佐劑的聯(lián)合使用對(duì)pcD/Tp92在兔體內(nèi)促進(jìn)T細(xì)胞增殖分

5、化有著明顯的加強(qiáng)作用;CS納米顆粒包裹核酸疫苗后較相應(yīng)未包裹核酸疫苗組并未能顯著促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化。
　　5. Tp的兔皮膚感染導(dǎo)致感染期內(nèi)各對(duì)照組Tp92特異性抗體水平有著顯著升高,對(duì)各疫苗組Tp92特異性抗體水平產(chǎn)生有一定刺激作用;pcD/IL-2基因佐劑對(duì)pcD/Tp92在感染期兔體內(nèi)Tp92特異性抗體水平的長(zhǎng)久促進(jìn)及維持有顯著作用,而CS納米顆粒的包裹對(duì)pcD/Tp92在感染期后階段兔體內(nèi)Tp92特異性抗體水平的長(zhǎng)久促進(jìn)及

6、維持無(wú)顯著作用。
　　6. Tp的兔皮膚感染導(dǎo)致感染期內(nèi)各對(duì)照組脾細(xì)胞的增殖分化有著顯著升高,對(duì)疫苗組脾細(xì)胞的增殖分化有一定促進(jìn);pcD/IL-2基因佐劑的聯(lián)合使用對(duì)pcD/Tp92在感染期兔體內(nèi)脾細(xì)胞的增殖水平的長(zhǎng)久促進(jìn)及維持的有顯著作用,而CS納米顆粒的包裹對(duì)pcD/Tp92在感染期兔體內(nèi)脾細(xì)胞的增殖水平的長(zhǎng)久促進(jìn)及維持無(wú)顯著作用。
　　7.各疫苗相比各對(duì)照組均能顯著降低Tp感染部位皮損Tp陽(yáng)性率及潰瘍病灶形成率,顯示出

7、較強(qiáng)的免疫保護(hù)效應(yīng);pcD/IL-2基因佐劑較之CS納米顆粒更能增強(qiáng)pCD/Tp92疫苗的免疫保護(hù)效果;兩者聯(lián)合使用可達(dá)到較之其它疫苗組更好的免疫效果。
　　8.在各實(shí)驗(yàn)組兔背部皮膚8個(gè)位點(diǎn)皮內(nèi)Tp感染后21d同比觀察比較,用CS+pCD/Tp92+pcD/IL-2聯(lián)合疫苗和pCD/Tp92+pcD/IL-2聯(lián)合疫苗免疫兔后感染位點(diǎn)皮損紅腫相對(duì)其它實(shí)驗(yàn)組直徑最小,潰瘍形成率最少;PcD/Tp92和CS+pcD/Tp92疫苗組兔后感

8、染位點(diǎn)皮損皮損紅腫直徑同比中等大小;各對(duì)照組(CS+pcD,pcD,CS+PBS,PBS對(duì)照組)感染位點(diǎn)皮損紅腫直徑最大,潰瘍病灶形成數(shù)最多。
　　9.各疫苗組皮損變化情況相比較顯示CS+pCD/Tp92+pcD/IL-2聯(lián)合疫苗組的兔感染位點(diǎn)皮損紅腫初期最大(4.5mm),在頂峰期紅腫直徑最小(10mm),紅腫消退的時(shí)間也最短(42d);pCD/Tp92疫苗組皮損紅腫早期最小(2mm),但頂峰期紅腫直徑最大(12mm),紅腫消退

9、的時(shí)間也最長(zhǎng)(>48d)。
　　結(jié)論:
　　1. CS+pcD/Tp92+pcD/IL-2聯(lián)合疫苗, pcD/Tp92+pcD/IL-2聯(lián)合疫苗, CS+pcD/Tp92疫苗及 pcD/Tp92疫苗組經(jīng)肌肉注射均可誘生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　2.pcD/IL-2基因佐劑可以顯著加強(qiáng)pcD/Tp92疫苗長(zhǎng)期穩(wěn)定的高抗體水平及高脾細(xì)胞增殖分化水平。
　　3.CS納米顆粒對(duì)pcD/Tp92疫苗的包裹的免疫效