聯(lián)合激光捕獲顯微切割與二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜研究低惡性膀胱移行細(xì)胞癌蛋白表達(dá)譜和生物通路.pdf

1、目的：膀胱癌是我國(guó)最常見(jiàn)的泌尿腫瘤。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，膀胱移行細(xì)胞癌從生物學(xué)行為到病理形態(tài)可分成低惡性與高惡性膀胱移行細(xì)胞癌兩種類(lèi)型(常被稱(chēng)之為兩類(lèi)癌)。兩類(lèi)癌概念的提出為人們從分子與基因水平對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌進(jìn)行分類(lèi)與研究提供了新的視角，并為闡明其發(fā)病機(jī)制與指導(dǎo)治療，以及推測(cè)預(yù)后提供了更具科學(xué)性的依據(jù)，具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。因此，本研究即是在其指引下，尋找其差異表達(dá)蛋白，探究低惡性膀胱移行細(xì)胞癌的生物標(biāo)記以及發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而揭示其發(fā)病規(guī)

2、律。同時(shí)，這也正是膀胱癌研究領(lǐng)域亟待解決的難題之一。 方法： 1．激光捕獲顯微切割獲得正常膀胱移行上皮細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞：采用Pix CellⅡLCM激光捕獲顯微切割設(shè)備獲得正常移行上皮以及腫瘤細(xì)胞各250，000shots，裂解后分別獲得 185.2μg、147.6μg總蛋白，為進(jìn)一步質(zhì)譜分析奠定基礎(chǔ)。 2．使用Finnigan線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(LTQ)進(jìn)行液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜鑒定正常上皮以及腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)表

3、達(dá)譜，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與目前已經(jīng)證實(shí)的膀胱癌及腫瘤差異表達(dá)蛋白進(jìn)行比較，同時(shí)選擇2個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫蛋白印跡以及免疫組織化學(xué)驗(yàn)證。 3．生物信息學(xué)工具分析鑒定的蛋白質(zhì)：使用蛋白質(zhì)分析工具鑒定蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，包括總體平均親水性，跨膜區(qū)預(yù)測(cè)，分子量以及等電點(diǎn)。并初步對(duì)比正常上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞表達(dá)蛋白的理化性質(zhì)。 4．以本表達(dá)譜中鑒定的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)為蛋白質(zhì)生物標(biāo)記尋找進(jìn)行循證生物醫(yī)學(xué)探索，以期得到生物標(biāo)記蛋白基

4、本理化性質(zhì)的特點(diǎn)。 5．GO軟件分析腫瘤蛋白質(zhì)表達(dá)譜以及差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜。GO分析的同時(shí)計(jì)算GO濃集/缺失表達(dá)，以了解腫瘤的細(xì)胞生理，并與尿液中蛋白質(zhì)的GO分析比對(duì)，探索尿液中侯選生物標(biāo)記蛋白的來(lái)源。 6．通路分析及可視化。將正常上皮細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)的IPI標(biāo)記號(hào)轉(zhuǎn)化為SWISSPORT-ACC-NUMBER，然后輸入ArrayTrack V.3.3.0 軟件包，對(duì)目前已知的生物通路進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，

5、檢索生物通路數(shù)據(jù)庫(kù)為KEGG。將差異表達(dá)蛋白質(zhì)的IPI標(biāo)記號(hào)轉(zhuǎn)化為Protein-RefSeQ，按照軟件要求的格式輸入GenMAPP軟件，實(shí)現(xiàn)生物通路的可視化。同樣的方法分析高惡性移行上皮癌的蛋白質(zhì)表達(dá)譜為進(jìn)一步分析兩類(lèi)癌的不同分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 結(jié)果： 1．蛋白質(zhì)表達(dá)譜結(jié)果：440個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，其中24個(gè)假定蛋白，24個(gè)疏水性蛋白質(zhì)(5．5％)，TMHMM程序預(yù)測(cè)跨膜蛋白38個(gè)(8．6％)，84個(gè)(19．1％

6、)蛋白質(zhì)PI>9；76個(gè)(17．3％)蛋白質(zhì)分子量<10 kDa或者>100 kDa。 2．免疫蛋白印跡以及免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：NHERF在腫瘤組織中的表達(dá)明顯上調(diào) (P<0．05)，TPD52 在腫瘤組織中特異性表達(dá) (P<0．05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：TPD52和NHERF 在膀胱癌中的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常膀胱粘膜中的表達(dá)陽(yáng)性率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。膀胱癌組織中TPD52 的陽(yáng)性表達(dá)率隨著腫瘤病理分級(jí)

7、的升高而增加 (P<0．05)，而與腫瘤浸潤(rùn)深度不具相關(guān)性(P>0．05)。NHERF 的表達(dá)與膀胱癌的病理分級(jí)、浸潤(rùn)深度均不具相關(guān)性(P>0．05)。 3．循證生物醫(yī)學(xué)探索結(jié)果：129個(gè)蛋白質(zhì)被定義為生物標(biāo)記，其他蛋白為非生物標(biāo)記，這兩個(gè)蛋白組間PI，MW，GRAVY，跨膜區(qū)均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。按照PI區(qū)分蛋白質(zhì)時(shí)，71個(gè)蛋白PI>9，317個(gè)蛋白PI≤9，這兩個(gè)組中分別有21和108個(gè)蛋白被定義為生物標(biāo)記，這兩個(gè)組之間的生物標(biāo)

8、記和非生物標(biāo)記的PI均數(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)差之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4.GO分析結(jié)果：低惡性膀胱移行上皮癌中共鑒定440個(gè)蛋白質(zhì)。按人類(lèi) GO slimv1.8劃分440個(gè)蛋白質(zhì)中具有生物學(xué)途徑、細(xì)胞成分、分子功能注解的蛋白質(zhì)分別為312個(gè)(70.9％)、304個(gè)(69.1％)、346個(gè)(78.6％)。按照GO 4級(jí)分支術(shù)語(yǔ)生物學(xué)途徑、細(xì)胞成分、分子功能中濃集/缺失表達(dá)的蛋白分別為 41/22、25/11、23/20種。按人類(lèi)GO slim

9、 v1.8 劃分差異表達(dá)蛋白質(zhì)中具有生物學(xué)途徑、細(xì)胞成分、分子功能注解的蛋白質(zhì)分別為267個(gè)(68.8％)、256個(gè)(66.0％)、297個(gè)(76.5％)。細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞循環(huán)、細(xì)胞分化、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的蛋白質(zhì)分別為10、13、9、10、37個(gè)。 5.數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建：數(shù)據(jù)庫(kù)包括4個(gè)主要內(nèi)容：標(biāo)本信息、實(shí)驗(yàn)過(guò)程、質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)、GO分析結(jié)果。質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)中包括蛋白質(zhì)名稱(chēng)、蛋白質(zhì)描述、多個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的登陸號(hào)、MW以及PI、

10、總體平均疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的交叉數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)記號(hào)也包括在質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)中，包括IPI，Swiss-port，TrEMBL，RefSeQ，Ensembl和H-Inv等。質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)采用XML格式。GO分析結(jié)果采用表格形式來(lái)描述蛋白質(zhì)的生物學(xué)途徑、分子功能以及細(xì)胞組分。按照GO分支術(shù)語(yǔ)將蛋白質(zhì)聚類(lèi)，儲(chǔ)存于同一數(shù)據(jù)層，同時(shí)包括蛋白質(zhì)的濃集/缺失表達(dá)分析。鑒定蛋白質(zhì)的IPI標(biāo)記號(hào)在數(shù)據(jù)庫(kù)中與GO分支術(shù)語(yǔ)直接關(guān)聯(lián)，因此擁有共同GO分支術(shù)語(yǔ)的蛋白列

11、表于同一數(shù)據(jù)層，GO分析中同時(shí)包含GO濃集/缺失表達(dá)分析。在數(shù)據(jù)庫(kù)中，用戶(hù)可以在GO等級(jí)術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)列表中指定感興趣的蛋白質(zhì)，通過(guò)超鏈接可以獲得儲(chǔ)存于歐洲生物信息學(xué)研究所的GO術(shù)語(yǔ)信息以及蛋白質(zhì)信息。同時(shí)為了方便用戶(hù)查詢(xún)，數(shù)據(jù)庫(kù)中提供了簡(jiǎn)單的根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)記號(hào)的查詢(xún)服務(wù)。數(shù)據(jù)庫(kù)儲(chǔ)存于 http：//www.Proteome-NHTE.org.cn，及http：//www.Proteome-SBTCC.org.cn。 6.生物通路分析

12、結(jié)果：ArrayTrack軟件分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示低惡性膀胱移行細(xì)胞癌中129個(gè)差異表達(dá)的蛋白定位于目前已知的生物通路，這些差異表達(dá)的基因主要屬于下列生物通路：氧化磷酸化、ECM受體相互作用、Toll-like受體通路、細(xì)胞通信、聚合黏附、核糖體、MAPK信號(hào)通路等。高惡性移行細(xì)胞癌中181個(gè)差異表達(dá)的蛋白定位于目前已知的生物通路，通路分析結(jié)果顯示，兩類(lèi)癌中涉及的差異通路基本一致，但每個(gè)通路中發(fā)生改變的蛋白并不相同。結(jié)果提示腫瘤

13、發(fā)生發(fā)展過(guò)程中涉及多基因、多通路復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)異常；兩類(lèi)癌存在不同的驅(qū)動(dòng)機(jī)制。 結(jié)論： 1．本研究在國(guó)內(nèi)首次聯(lián)合應(yīng)用激光捕獲顯微切割與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了膀胱癌差異表達(dá)蛋白譜。在低惡性膀胱移行細(xì)胞癌與相應(yīng)正常膀胱粘膜之間選出388個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中包括305個(gè)特異表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，83個(gè)特異表達(dá)于正常上皮細(xì)胞，說(shuō)明膀胱癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在多蛋白質(zhì)表達(dá)異常，這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)為膀胱癌分子機(jī)制研究提供了大量有價(jià)值的信息

14、。 2．在差異表達(dá)蛋白譜中挑取出2個(gè)差異蛋白TPD52，NHERF進(jìn)行經(jīng)典的免疫蛋白印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示與正常膀胱粘膜比較，TPD52，NHERF 水平在低惡性膀胱移形細(xì)胞癌中差異表達(dá)，而且這兩個(gè)蛋白均通過(guò)一個(gè)肽段鑒定，證實(shí)了聯(lián)合激光捕獲顯微切割與串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行表達(dá)譜研究的可靠性。應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究了TPD52 和 NHERF 在膀胱癌組織中的表達(dá)及臨床意義，結(jié)果顯示：TPD52和NHERF 在膀胱癌中表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常膀胱粘

15、膜中的表達(dá)陽(yáng)性率，差異均有顯著意義(P<0．05)。膀胱癌組織中 TPD52的陽(yáng)性表達(dá)隨著腫瘤病理分級(jí)的升高而增加(P<0．05)，而與浸潤(rùn)深度無(wú)相關(guān)性(P>0．05)。NHERF的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、病理分級(jí)均不具相關(guān)性(P>0．05)。 3．循證分析的結(jié)果顯示：PI、MW 不能預(yù)測(cè)生物標(biāo)記，尚需要發(fā)展其他方法來(lái)指導(dǎo)2DE蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的選擇性切膠；Shotgun策略不但擴(kuò)大了蛋白質(zhì)的檢出范圍，同樣擴(kuò)大了生物標(biāo)記

16、的檢出；蛋白質(zhì)的基本理化描述，包括PI, MW，跨膜預(yù)測(cè)，GRAVY對(duì)生物標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)沒(méi)有預(yù)測(cè)意義；尚需要發(fā)展其他的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法來(lái)預(yù)測(cè)為知蛋白成為生物標(biāo)記的可能性。 4．對(duì)腫瘤蛋白質(zhì)表達(dá)譜的GO濃集/缺失表達(dá)分析對(duì)深入了解低惡性淺表膀胱移行細(xì)胞癌的細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了理論依據(jù)，并根據(jù)PubMed文本信息挖掘揭示了傾向于在尿液中濃集表達(dá)的蛋白質(zhì)類(lèi)別，為制備小型蛋白質(zhì)芯片從尿液中無(wú)創(chuàng)檢測(cè)腫瘤提供了理論依據(jù)，并進(jìn)一步證實(shí)

17、了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。 5．按照國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)研究慣例，在蛋白質(zhì)鑒定信息以及功能分析的基礎(chǔ)上，建立了開(kāi)放數(shù)據(jù)庫(kù)，為蛋白質(zhì)信息交流和比對(duì)提供了平臺(tái)。GO分支術(shù)語(yǔ)以及蛋白質(zhì)列表均與歐洲生物信息學(xué)中心建立超鏈接。用戶(hù)可以在任何等級(jí)指定GO術(shù)語(yǔ)，或者選定列表中的蛋白質(zhì)，通過(guò)超鏈接獲得儲(chǔ)存于OuickGO(http：//www.ebi.ac.uk/ego/)的GO數(shù)據(jù)或者存放于歐洲生物信息學(xué)研究所數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac