調免毓麟湯對雄性大鼠免疫性不育的作用及其機理研究.pdf

1、目的:本課題旨在從理論上闡明“腎虛肝實”是免疫性不育的基本病機，采用同種異體主動免疫法建立雄性大鼠免疫性不育疾病模型，觀察調免毓麟湯對模型大鼠精液參數(shù)、睪丸組織結構、精液酸性磷酸酶、睪丸生精細胞凋亡、大鼠睪丸bcl-2、bax表達以及雄鼠抗精子抗體(AsAb)轉陰率、配對雌鼠妊娠率的影響，初步揭示免疫性不育的病理機制和調免毓麟湯的治療機理。 方法: ①本實驗在120只3月齡sD雄性大鼠中隨機取10只作為正常對照組，另取6

2、0只大鼠給予雙側腹股溝皮下淋巴結周圍、頸背部脊柱兩側皮下六個部位各注射抗原進行免疫，7天后于上述相同部位加強免疫，分別于初次免疫前及每次加強免疫后斷尾取血10ul，分離血清，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測血清AsAb。經過四次免疫后，有57只大鼠血清AsAb為陽性。將57只抗精子抗體陽性大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為模型組、醋酸強的松組、調免毓麟湯低劑量組、調免毓麟湯中劑量組、調免毓麟湯高劑量組分別灌胃給藥。其中正常組及模型組灌服生理

3、鹽水，調免毓麟湯各劑量組灌服調免毓麟湯煎劑，醋酸強的松組灌服醋酸強的松溶液，均每日一次，連續(xù)30天。 ②觀察調免毓麟湯對模型大鼠精液參數(shù)影響，分別在光鏡和透射電鏡下觀察睪丸組織形態(tài)學變化。 ③采用酸性磷酸酶(ACP)試劑盒檢測大鼠精液ACP，測定調免毓麟湯對模型大鼠精液ACP活性的影響。 ④用流式細胞儀檢測實驗各組大鼠生精細胞凋亡情況。 ⑤采用免疫組織化學法檢測實驗各組大鼠睪丸組織凋亡相關基因bcl-2、

4、bax 的表達情況。 ⑥統(tǒng)計調免毓麟湯對模型大鼠AsAb轉陰率以及與配對雌鼠合籠后的妊娠率和胚胎數(shù)。 結果: ①模型大鼠精液參數(shù)變化：模型大鼠精子密度、活率、直線運動速度等精液參數(shù)顯著下降，與正常組及各治療組比較有極顯著性差異(P<0.01)；醋酸強的松組大鼠精液參數(shù)與調免毓麟湯中、高劑量組比較有顯著性差異(P<0.05)。 ②睪丸組織顯微、超微結構觀察：光鏡下可見模型組大鼠睪丸曲細精管萎縮，管腔內上皮變

5、薄，部分生精細胞核固縮、變性，間質水腫，部分間質細胞空泡變性。調免毓麟湯各劑量組與醋酸強的松組睪丸組織各級生精細胞增加，曲細精管結構趨于完整，其睪丸組織的病理損害均有不同程度的修復，調免毓麟湯中、高劑量組較之醋酸強的松組的修復作用更好。透射電鏡觀察可見模型組睪丸支持細胞與各級生精細胞的損傷最嚴重：支持細胞胞漿內出現(xiàn)大量空泡，各級生精細胞核周間隙增寬，線粒體腫脹，精子細胞少見。治療組對于睪丸支持細胞與各級生精細胞的損傷均有修復作用，調免毓

6、麟湯中、高劑量組能明顯減輕生精細胞的受損程度。 ③模型大鼠精液 ACP 活性變化：模型組大鼠精液 ACP 活性顯著下降，與正常組比較有顯著性差異(P<0.01)；醋酸強的松組 ACP 活性與調免毓麟湯中、高劑量組比較有極顯著性差異(P<0.01)；調免毓麟湯中、高劑量組間比較無顯著性差異(P>0.05)。 ④模型大鼠睪丸生精細胞凋亡數(shù)、凋亡率測定：模型組大鼠睪丸生精細胞出現(xiàn)大量凋亡細胞，醋酸強的松組凋亡細胞數(shù)及凋亡率低于

7、模型組，兩者比較有極顯著性差異(P<0.01)；調免毓麟湯低劑量組與醋酸強的松組比較差異不顯著(P>0.05)；調免毓麟湯中、高劑量組與醋酸強的松組比較有極顯著性差異(P<0.01)。 ⑤模型大鼠睪丸組織凋亡相關基因表達情況：與正常組比較，模型組大鼠睪丸組織bcl-2蛋白表達下降，bax蛋白表達上升；與模型組比較，調免毓麟湯中、高劑量組大鼠睪丸組織bcl-2蛋白表達顯著上升，bax蛋白表達顯著下降。 ⑥實驗各組大鼠AsA

8、b轉陰率及與配對雌鼠合籠后胚胎數(shù)、妊娠率的統(tǒng)計：治療第30天，調免毓麟湯各劑量組與醋酸強的松組比較有顯著性差異(P<0.05)，調免毓麟湯各劑量組之間比較差異不顯著(P>0.05)；統(tǒng)計妊娠率及每胎胚胎數(shù)顯示，調免毓麟湯各劑量組與模型組比較有顯著性差異(P<0.01)；調免毓麟湯各劑量組與醋酸強的松組比較有顯著性差異(P<0.01)。 結論:本課題提出了“腎虛肝實”是免疫性不育基本病機的觀點，根據中醫(yī)基本理論闡釋了免疫性不育的發(fā)

9、病機理。通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，調免毓麟湯能顯著提高模型大鼠精子密度、活率及直線運動速度，對睪丸組織的病理損害具有良好的修復作用；調免毓麟湯高劑量組能顯著提高模型大鼠精液ACP的活性，從而抑制AsAb的產生，提高生育力；調免毓麟湯中、高劑量組能顯著降低模型大鼠生精細胞凋亡率，提高模型大鼠各級生精細胞數(shù)量；調免毓麟湯能上調抑凋亡基因bcl-2蛋白的表達，下調促凋亡基因bax蛋白的表達；調免毓麟湯能使模型大鼠AsAb轉陰，調免毓麟湯各劑量組妊娠率

10、、每胎胚胎數(shù)均高于醋酸強的松組及模型組。 免疫性不育的病機責之于腎虛肝實，而虛實夾雜是其特點。根據《內經》“虛則補之，實則瀉之”的原則，調免毓麟湯緊扣“腎虛肝實”病機，以補益腎氣，清利濕熱，活血化瘀立法，共奏腎肝同治，補瀉兼施之功，從而起到糾正免疫紊亂、恢復正常免疫功能的作用。調免毓麟湯通過在不同環(huán)節(jié)和機制上發(fā)揮作用，能使免疫性不育大鼠血清AsAb轉陰，顯著提高模型大鼠的生育力。其功效也反證了免疫性不育“腎虛肝實”病機理論的科學