骨髓間質干細胞對不同微環(huán)境刺激應答差異的比較分析.pdf

1、腫瘤的發(fā)生一直是困擾人類的醫(yī)學問題之一。長期以來，人們對于腫瘤的起源存在著各種爭論。傳統(tǒng)觀念認為腫瘤細胞來源于已分化細胞的去分化，并經過發(fā)展和演進，最終導致腫瘤發(fā)生。在啟動階段，分化成熟細胞受到致癌因素的刺激，基因發(fā)生突變；被啟動的細胞若進一步受到有絲分裂原的刺激，并經過數次細胞增殖，將DNA損傷永久固定在細胞內，進入促進階段；促進階段的細胞若進一步發(fā)生累加突變，則最終將演變?yōu)槟[瘤細胞。但是已分化細胞生命周期短，其染色體的突變要固定下來

2、并傳給子代細胞的機會不大。隨著對干細胞研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)干細胞在體內長期存在，并能自我復制和分化，正是由于其在體內的長期存在，使得基因突變更容易在這些細胞中積聚，同時通過自我復制使DNA損傷在細胞內固定下來并傳給子代細胞，干細胞是腫瘤啟動的天然靶細胞。 正常機體內，干細胞的存在與組織損傷修復、細胞更新有關，是長期進化中形成的對人體的保護機制。研究表明，腫瘤細胞與干細胞具有許多相似性，腫瘤細胞很可能起源于不同分化階段的干細胞，腫

3、瘤內有干細胞類群的存在。正常干細胞發(fā)揮功能時能夠根據機體的需要和遺傳約束力在增殖與分化之間達到完美的平衡，腫瘤細胞則無法在二者之間達成平衡，是脫離正常生長調控系統(tǒng)，不受增殖調控的細胞。種種跡象表明，干細胞正常分化通路的阻斷和干擾可能是腫瘤發(fā)生的一個重要原因。然而，究竟是何原因使干細胞背離了正確的分化方向?腫瘤中的干細胞是否來源于正常的干細胞?是否存在有獨立的“腫瘤干細胞”?若能找出這些問題的答案，對于深入理解腫瘤的發(fā)生機制，進而制定有效

4、的腫瘤防治策略無疑具有十分重要的意義。本課題組前期工作利用肝損傷大鼠模型(2-AAF/CC1<,4>模型)的肝組織萃取物營造的微環(huán)境，成功地將骨髓間質干細胞誘導分化為肝細胞，并構建了骨髓間質干細胞向肝細胞定向分化的實驗體系。被誘導細胞第7天表達幼稚肝細胞標志GST-P和M<,2>-PK，第20天表達成熟肝細胞的標志Albumin。在另一組實驗中，我們使用化學誘癌劑3’-甲基-奶油黃(3’-me-DAB)飼喂同一種動物，卻誘發(fā)出肝癌。由此

5、推測，在2-AAF/CC1<,4>構建的肝損傷大鼠模型中包含有適合干細胞正常分化的微環(huán)境，而在化學誘癌模型中則可能含有阻斷和干擾干細胞正常分化通路的因子。本研究擬通過兩種不同的肝組織萃取物(2-AAF/CC1<,4>肝損傷組織萃取物和3’-me-DAB化學誘癌肝組織萃取物)，分別營造兩個不同的細胞生長微環(huán)境，以觀察骨髓間質干細胞在不同微環(huán)境下的各種生物學變化特征，試圖揭示腫瘤發(fā)生與干細胞之間的內在聯(lián)系。 實驗方法： 1.

6、骨髓間質干細胞的獲取從SD雄性大鼠的雙側股骨和脛骨中用DMEM/F-12沖洗骨髓細胞，采用貼壁法分離出骨髓間質細胞。采用換半液和一傳二的傳代培養(yǎng)方法，傳至第4代。 2.分化刺激物的制備及骨髓間質干細胞的定向誘導分化構建2-AAF/CCL<,4>急性肝損傷動物模型，獲取動物肝臟，提取肝組織萃取物。用此萃取物誘導第4代骨髓間質干細胞，并分別收集7天、20天細胞。 3.分化干擾刺激物的制備及骨髓間質干細胞分化的干擾實驗構建化學

7、誘癌動物模型，選取第17周和第14周動物，獲取動物肝臟，提取肝組織萃取物。用此萃取物刺激第4代骨髓間質干細胞，并分別收集7天、20天細胞。 4.骨髓間質干細胞在不同微環(huán)境下生物學變化特征的觀察分析通過細胞形態(tài)學、細胞周期、核型分析及分子表達譜諸方面的比較觀察，分析不同微環(huán)境對干細胞正常分化途徑的影響。 實驗結果： 1.在細胞形態(tài)上，分化組細胞在誘導第6天可見成纖維樣細胞細長突起縮短，12天后細胞主要呈簇狀緩慢生長

8、，中央區(qū)域細胞突起完全消失呈圓形或近圓形上皮樣形態(tài)，外周細胞大部分細胞呈短梭形，15-18天，上皮樣細胞繼續(xù)增多，至20天時幾乎所有的細胞均呈上皮樣。分化干擾組細胞在刺激第7天長梭形細胞胞體縮短，變寬，11天后中央區(qū)細胞可見少量細胞突起消失呈類圓形，但外周細胞仍保持短梭形，并保持這種形態(tài)至第20天。 2.在分子表達譜上，分化組細胞在誘導第7天出現(xiàn)幼稚肝細胞的標志GST-P和M<,2>-PK，在誘導第20天出現(xiàn)成熟肝細胞的標志A

9、lbumin，分化干擾組細胞刺激第7天出現(xiàn)幼稚肝細胞的標志GSTP和M<,2>PK，并持續(xù)表達至第20天，刺激第20天時未見成熟肝細胞標志Abumin的表達。 3.細胞周期上，分化組細胞G<,0>/G<,1>91.4﹪～91.9﹪，S期5.8﹪～7.4﹪、G<,2>/M1．1﹪～2.3﹪，PI值8.1～8.6；與分化組比較，分化干擾組細胞G<,0>/G<,1>比例降低，S期、G<,2>/M期比例升高，PI值增高，分化干擾組細胞

10、增殖活性高。 4.在染色體核型分析上，分化組細胞染色體從數42，染色體范圍37～46，染色體少于40占總計數核型的15﹪，分化干擾組細胞染色體從數36～45，染色體范圍增寬，染色體少于40的百分率增加，高出分化組22﹪。 5.在細胞超微結構上，分化組細胞呈單層平鋪生長，分化干擾組細胞在刺激第7天時亦呈單層平鋪生長，但在刺激第20天時部分細胞呈多層重疊生長，失去接觸抑制。 結論： 1.骨髓間質干細胞在分化誘

11、導條件下，細胞形態(tài)呈現(xiàn)出由最初的以長梭形細胞為主逐漸演變?yōu)橐陨掀蛹毎麨橹鞯奶卣餍宰兓?，符合骨髓間質干細胞向肝細胞分化過程中展現(xiàn)的形態(tài)學特點。而在分化干擾條件下，細胞則始終保持以長梭形細胞為主的形態(tài)特征。由此可以判斷，微環(huán)境的差異己使骨髓間質干細胞的分化進程受到了影響。 2.在分化誘導條件下，骨髓問質干細胞分別于誘導刺激的第7天表達幼稚肝細胞的分子標志GST-P和M<,2>-PK，于第20天表達成熟肝細胞的分子標志Albumin

12、，實現(xiàn)了向肝細胞的終末分化。在分化干擾實驗中，骨髓間質干細胞僅在干擾刺激的第7天表達出幼稚肝細胞的分子標志GST-P和M<,2>-PK，卻始終未能表達成熟肝細胞的分子標志Albumin。實驗表明，骨髓間質干細胞向肝細胞的分化進程已被阻滯在幼稚肝細胞階段。 3.在分化干擾條件下，處于S期和G<,2>/M期的細胞比例以及代表細胞增殖活性的PI值均高于分化誘導條件下的細胞，表明不同的微環(huán)境條件對細胞的增殖活性有重要影響。 4.

13、在分化干擾條件下，細胞染色體范圍19-84和非整倍體百分率46﹪明顯高于分化誘導狀態(tài)下的細胞(染色體范圍37-46，非整倍體百分率15﹪)，提示細胞染色體組型的穩(wěn)定性有所降低。 5.掃描電鏡結果顯示，干擾刺激第20天的細胞出現(xiàn)多層疊加生長的現(xiàn)象，生長方式與肝癌細胞株HepG2相似。提示，部分細胞的接觸抑制能力喪失。 6.經比較分析發(fā)現(xiàn)，骨髓間質干細胞在分化干擾條件下，無論在細胞形態(tài)學、細胞周期、染色體組型穩(wěn)定性、細胞超微