HCMV體外感染鼠胚成纖維細(xì)胞與感染復(fù)數(shù)相關(guān)性的實驗研究.pdf

1、目的：研究人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在體外可以增殖性感染鼠胚成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblast，MF)，探討HCMV體外增殖性感染MF細(xì)胞與感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的相關(guān)性，為HCMV跨種屬感染的分子機(jī)制研究奠定實驗基礎(chǔ)。 方法：HCMV AD169毒株復(fù)蘇感染人胚成纖維細(xì)胞(human embryo fibrobla

2、st，HF)，連續(xù)傳代三次，待細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)達(dá)“4+”時，反復(fù)吹打使病毒釋放，4℃ 3 000 rpm離心10 min，收獲上清：部分上清作PFU試驗測定病毒滴度，其余凍存于-80℃冰箱；設(shè)定MOI為0.1、1、10和100，根據(jù)測定出的病毒滴度和細(xì)胞計數(shù)，算出各MOI所需病毒量，分別接種至6孔培養(yǎng)板對應(yīng)的MF細(xì)胞和HF細(xì)胞上，置5％CO<,2>溫箱37℃培養(yǎng)，次日換維持液，逐日鏡下觀察HCM

3、V特征性CPE；分別在第1、2、5、7、10和14 d收集細(xì)胞和培養(yǎng)物上清，進(jìn)行下列各項實驗：(1)培養(yǎng)物上清采用PFU試驗檢測其中的病毒滴度；(2)收集的細(xì)胞用于進(jìn)行RT-PCR半定量檢測HCMV IE和UL83基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；(3)第14 d后的細(xì)胞培養(yǎng)物用于抽提DNA基因組，行PCR檢測HCMV UL83基因驗證病毒；(4)采用透射電鏡觀察不同MOI感染的MF和HF細(xì)胞內(nèi)有無皰疹病毒樣病毒顆粒形態(tài)特征，在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位

4、以及感染的MF和HF細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化與MOI的關(guān)系。 結(jié)果：以MOI為0.1和1感染MF和HF細(xì)胞時，MF細(xì)胞在2周的培養(yǎng)過程中沒有觀察到CPE的產(chǎn)生，HF細(xì)胞分別在第10 d和第7 d出現(xiàn)了較為明顯的特征性CPE，光鏡下觀察可見部分細(xì)胞腫脹、變圓、折光性增強(qiáng)等特征；以MOI為10和100感染：MF和HF細(xì)胞時，MF細(xì)胞分別在第7 d和第5 d出現(xiàn)了明顯的特征性CPE，HF細(xì)胞分別在第5 d和第3 d出現(xiàn)了明顯的特征性CPE，光

5、鏡下所見同前。 隨著時間的延長，細(xì)胞病變明顯加重，顆粒狀物越來越多，CPE擴(kuò)展至整個單層細(xì)胞。MOI為0.1和1感染MF細(xì)胞后各時間點(diǎn)的培養(yǎng)物上清經(jīng)PFU試驗測定，均在第1和2 d的取樣中檢測到病毒的滴度很低，其他5個時間點(diǎn)未檢測到空斑形成。MOI為10和100感染MF細(xì)胞后各時間點(diǎn)的培養(yǎng)物PFU測定結(jié)果顯示：MOI為100時感染MF細(xì)胞，第1 d培養(yǎng)物上清中病毒滴度為5.8×10<'1>PFUs/ml，第2 d病毒滴度增高到1

6、.5×10<'2> PFUs/ml，在感染的第5 d病毒度的滴度高達(dá)2.1×10<'5>PFUs/ml，等到感染的第10 d時，病毒的滴度達(dá)到了高峰，為1.2×10<'7>PFUs/ml，接下來隨著病變細(xì)胞的死亡病毒滴度開始下降，到第14 d病變細(xì)胞完全脫落死亡時，病毒滴度降為3.4×10<'5>PFUs/ml，這與在鏡下觀察到出現(xiàn)特征性CPE的時間基本一致。MOI為10時病毒滴度的變化趨勢和MOI為100時基本一致，但MOI為10時，

7、在第14 d時MF病變細(xì)胞并沒有完全死亡脫落。而與MF平行設(shè)置的HF細(xì)胞對照中，四個MOI中PFU試驗均可檢測到空斑的形成且病毒滴度隨時間的延長逐漸增高，直到病變細(xì)胞死亡后病毒滴定開始下降；MOI為10和100時，病毒滴度的遞增趨勢與HF平行對照中檢測的結(jié)果相類似。本研究中，對四個MOI第14 d后的培養(yǎng)物用PCR進(jìn)行了驗證，MOI為0.1，1，10和100時均可在766bp處擴(kuò)增出HCMV UL83基因的特異性條帶。RT-PCR半定量

8、檢測結(jié)果顯示：MOI為0.1和1時，未檢測到HCMV IE和UL83 mRNA的轉(zhuǎn)錄；而MOI為10和100時均檢測到了HCMV IE和UL83 mRNA的轉(zhuǎn)錄且轉(zhuǎn)錄水平隨著時間的推移呈遞增趨勢，直逐漸達(dá)高峰，隨后呈下降趨勢。透射電鏡觀察結(jié)果：在MOI為0.1和1時，電鏡觀察MF細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外未見皰疹樣病毒顆粒；而MOI為10和100時，在透射電鏡下可見MF細(xì)胞內(nèi)有皰疹樣病毒顆粒存在。 結(jié)論：(1)本研究通過PFU試驗準(zhǔn)確測定感