促紅細(xì)胞生成素聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子治療急性心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)研究EPO聯(lián)合G-CSF對(duì)缺氧心肌細(xì)胞以及急性心肌梗死的大鼠動(dòng)物模型心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響，探討EPO聯(lián)合G-CSF治療對(duì)急性心肌梗死造成的左室重塑和心功能下降的改善作用以及可能的分子機(jī)制，從而為急性心肌梗死的治療提供新的思路。 方法：采用胰酶消化法分離乳鼠心肌細(xì)胞并對(duì)分離細(xì)胞進(jìn)行傳代。采用95％N2+5％CO2氣體充分置換的1％的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，建立缺氧心肌細(xì)胞模型．研究不同濃度的EPO和G-CSF對(duì)

2、缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。研究最佳治療濃度時(shí)，EPO、G-CSF和聯(lián)合治療對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的存活率、凋亡率和壞死率． 將心肌細(xì)胞分為5組，正常對(duì)照組、缺氧組、缺氧+EPO組、缺氧+G-CSF組和缺氧+EPO+G-CSF組。建立缺氧模型24h后收集5組心肌細(xì)胞標(biāo)本。采用Northern-blot方法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中的Bcl-2，Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá)，采用Western-

3、blot方法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中的Cyt C、STAT-3、caspase-3蛋白的表達(dá)。 采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立大鼠心肌梗死動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組：假手術(shù)組、心肌梗死組、心梗+EPO組，心梗+G-CSF組和心梗+EPO+G-CSF組．第1d、7d、28d時(shí)收集血液標(biāo)本，檢測(cè)血常規(guī)和生化學(xué)指標(biāo)．建立模型后第1d、7d時(shí)收集心臟標(biāo)本，采用Northern-blot方法檢測(cè)各組梗死區(qū)和梗死周?chē)鷧^(qū)組織中的Bcl-2、Bax

4、、Caspase-3 mRNA的表達(dá)；采用Western-blot方法檢測(cè)Cyt C、S17AT-3、Caspase-3蛋白的表達(dá)；采用TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡；采用HE染色觀(guān)察心肌組織形態(tài)；第28d時(shí)收集心臟標(biāo)本，行HE染色、Masson三色染色、天狼猩紅膠原染色和Ⅷ因子染色，觀(guān)察心肌梗死區(qū)和梗死周?chē)鷧^(qū)心肌組織存活、瘢痕形成、膠原沉積、血管新生情況。第7d和28d時(shí)行超聲心動(dòng)圖檢查評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)和心功能，第28d時(shí)行血流動(dòng)力學(xué)檢查

5、評(píng)價(jià)心功能。 結(jié)果：成功分離了乳鼠心肌細(xì)胞并進(jìn)行傳代．成功建立了心肌細(xì)胞缺氧模型。缺氧心肌細(xì)胞死亡率和凋亡細(xì)胞在總壞死細(xì)胞中比例明顯高于正常心肌細(xì)胞(26.73％vs．5.63％，70.05％vs．37.83％，P＜0.001)。1U/ml EPO開(kāi)始發(fā)揮對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，5U/ml、25U/ml和125U/ml的保護(hù)作用相似；6ng/ml G-CSF開(kāi)始發(fā)揮對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，150ng/ml保護(hù)作用最強(qiáng)、30n

6、g/ml和750ng/ml保護(hù)作用相似。EPO、G-CSF和聯(lián)合給藥明顯減少缺氧心肌細(xì)胞的凋亡率和總死亡率(18.73％vs．6.01％vs．7.08％vs．4.57％，P＜0.001；26.73％vs．9.54％vs．11.6％vs．8.15％，P＜0.001)； EPO與G-CSF組保護(hù)作用相近(P＞0.05)；聯(lián)合給藥組保護(hù)作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)EPO(P＜0.001)與G-CSF(P＜0.001)給藥組。 與缺氧組相比：EPO

7、組和G-CSF組Bcl-2 mRNA表達(dá)增加(P＜0.01)，BaxmRNA，Caspase-3 mRNA和Caspase-3蛋白表達(dá)減少(P＜0.01)，聯(lián)合治療組作用最明顯，強(qiáng)于單獨(dú)藥物治療組(P＜0.01)，而EPO和G-CSF組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)；EPO組Cyt C蛋白表達(dá)略低(P＞0.05)，G-CSF組和聯(lián)合治療組明顯降低(P＜0.05)；聯(lián)合治療組，STAT-3蛋白表達(dá)增高(P＜0.01)。 血常規(guī)和生

8、化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)顯示：5組動(dòng)物的血常規(guī)檢測(cè)在建模后第7d、28d沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)．建模后第1d、7d、28d時(shí)5組動(dòng)物的CRE、BUN未見(jiàn)顯著差異(P＞0.05)。給予EPO和G-CSF治療，心肌梗死后第1d，ALT、AST、CK、CK-MB、TNT的表達(dá)降低(P＜0.01)；心肌梗死后第7d，CK、CK-MB、TNT的表達(dá)降低(P＜0.01)，聯(lián)合治療組降低最多(P＜0.01)． 心肌梗死后第1d時(shí)，EPO和G-CS

9、F組Bcl-2 mRNA的表達(dá)增加(P＜0.01)；Bax mRNA(P＜0.01)和Caspase-3 mRNA的表達(dá)減少(P＜0.01)；聯(lián)合治療效果更為明顯，優(yōu)于EPO和G-CSF單獨(dú)治療(P＜0.01)。第7d時(shí)Bcl-2，Bax，Caspase-3 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)與第1d時(shí)相似，但是表達(dá)水平明顯低于第1d(P＜0.01)。心肌梗死后第1d時(shí)，EPO和G-CSF組Cyt C和Caspase-3蛋白表達(dá)減少(P＜0.01)；S

10、TAT-3蛋白表達(dá)增加(P＜0.01)；聯(lián)合治療效果更為明顯，優(yōu)于EPO和G-CSF單獨(dú)治療(P＜0.01)。第7d時(shí)各組蛋白表達(dá)趨勢(shì)與第1d時(shí)相似，表達(dá)水平明顯下降(P＜0.01)． 超聲心動(dòng)圖檢查顯示：第7d時(shí)所有藥物干預(yù)組的LVEF和FS增高(P＜0.01)：聯(lián)合治療組心功能改善最為明顯(P＜0.01)；LVESD和LVESV降低明顯(P＜0.01)．第28d時(shí)所有藥物干預(yù)組的LVEF和FS明顯增高(P＜0.01)：聯(lián)合治

11、療組心功能改善最為明顯(P＜0.01)，高于單獨(dú)藥物治療組(P＜0.01)；所有藥物干預(yù)組的LVESD、LVEDD、LVESV、LVEDV降低明顯(P＜0.01)。血流動(dòng)力學(xué)分析顯示：所有藥物干預(yù)組的LVEDP都降低，LVSP和+dP/dtmax均增高，大鼠心臟的收縮和舒張功能均得到了改善。聯(lián)合治療組心功能改善最為明顯(P＜0.01)．心肌梗死后第1d時(shí)，心肌梗死組中即有大量的凋亡細(xì)胞，明顯高于EPO組和G-CSF組，聯(lián)合治療組凋亡細(xì)胞

12、數(shù)量最少(P＜0.01)．第7d時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)量分布的趨勢(shì)與第1d時(shí)相同，凋亡細(xì)胞數(shù)量較第1d時(shí)明顯減少． 心肌梗死后第28d時(shí)，Ⅷ因子染色顯示，藥物治療組梗死區(qū)和梗死周?chē)鷧^(qū)血管增生明顯增多(P＜0.01)，聯(lián)合治療組新生血管數(shù)量最多(P＜0.01)．Masson染色顯示，藥物治療組梗死區(qū)和梗死周?chē)鷧^(qū)纖維瘢痕形成減少，聯(lián)合治療組纖維瘢痕形成最少。天狼猩紅染色顯示，藥物治療組梗死區(qū)和梗死周?chē)鷧^(qū)膠原沉積減少，聯(lián)合治療減少最明顯。HE

13、染色顯示：藥物治療組殘存的心肌細(xì)胞增加、纖維瘢痕組織減少，聯(lián)合治療組最明顯。 結(jié)論：5U/ml的EPO和30ng/ml的G-CSF是其發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用的最佳濃度。EPO、G-CSF聯(lián)合給藥對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)的EPO或G-CSF治療。缺氧心肌細(xì)胞中，EPO增加Bcl-2和STAT-3表達(dá)，減少Bax和Caspase-3的表達(dá)，說(shuō)明其可能通過(guò)JAK-STAT途徑發(fā)揮抗凋亡的作用。G-CSF輕度增加STAT-3表

14、達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)，減少Bax、Cyt C和Caspase-3的表達(dá)，說(shuō)明G-CSF可能主要通過(guò)線(xiàn)粒體途徑，部分通過(guò)JAK-STAT途徑發(fā)揮抗凋亡的作用．EPO聯(lián)合G-CSF治療，明顯增加STAT-3和Bcl-2的表達(dá)，明顯減少Bax、Cyt C和Caspase-3的表達(dá)，反映可能通過(guò)線(xiàn)粒體途徑和JAK-STAT途徑聯(lián)合發(fā)揮更強(qiáng)的抗凋亡的作用。EPO聯(lián)合G-CSF治療在動(dòng)物體內(nèi)安全可行，可能通過(guò)JAK-STAT途徑和線(xiàn)粒體途徑，發(fā)揮