調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)日本血吸蟲(chóng)GST疫苗保護(hù)性效果的影響及機(jī)制研究.pdf

1、寄生蟲(chóng)能逃避宿主的免疫攻擊而繼續(xù)生存的現(xiàn)象稱為免疫逃避，其機(jī)理為分子模擬與偽裝、封閉抗體的產(chǎn)生等多種方式逃避宿主的體液和細(xì)胞免疫攻擊，因而寄生蟲(chóng)能在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存在并引起慢性感染。新近證實(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與寄生蟲(chóng)逃避宿主免疫攻擊有關(guān)，即“病原體可能會(huì)利用調(diào)節(jié)性T細(xì)胞當(dāng)做逃生的窗口”，如利什曼原蟲(chóng)感染部位聚集了大量的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而有利于原蟲(chóng)的存活，若用抗體阻斷調(diào)節(jié)性T細(xì)胞則有利于機(jī)體清除原蟲(chóng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞最早于1995年由Sakaguchi

2、等描述，主要包括自然性和誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞兩種類型。誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞由外來(lái)抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生，自然性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞即CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，來(lái)源于胸腺并維持于外周，組成性表達(dá)CD25、Foxp3、CTLA-4和GITR等分子。CD25分子即IL-2受體的α鏈，對(duì)于維持調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖及功能具有重要作用，但CD25分子同時(shí)也表達(dá)于活化的效應(yīng)細(xì)胞表面，因而不具有特異性。Foxp3為核轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特征性標(biāo)志。CTLA-4（細(xì)胞

3、毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4）是一種共抑制性受體，CTLA-4與機(jī)體的免疫耐受功能相關(guān)。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能抑制CD4+和CD8+效應(yīng)T細(xì)胞的激活，其抑制功能是由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞之間直接接觸或者由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β來(lái)實(shí)現(xiàn)的，單獨(dú)及聯(lián)合使用相應(yīng)的阻斷性抗體有利于機(jī)體清除寄生蟲(chóng)感染。日本血吸蟲(chóng)疫苗的研究經(jīng)歷了死疫苗、減弱活疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗的漫長(zhǎng)過(guò)程，仍未取得較好的效果。WHO推薦的

4、六種候選疫苗包括谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶均不能穩(wěn)定地獲得40％以上的保護(hù)力。既然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能抑制效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)，因此推測(cè)日本血吸蟲(chóng)在宿主體內(nèi)免疫逃避及日本血吸蟲(chóng)疫苗的免疫保護(hù)性效果不佳均可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有關(guān)。本文一方面探討了日本血吸蟲(chóng)感染與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間的關(guān)系，采用相應(yīng)抗體阻斷調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，觀察其對(duì)機(jī)體清除日本血吸蟲(chóng)感染能力的影響及其作用機(jī)制。另一方面探討了日本血吸蟲(chóng)疫苗與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間的關(guān)系，采用相應(yīng)抗體阻斷調(diào)節(jié)性T

5、細(xì)胞觀察其對(duì)日本血吸蟲(chóng)疫苗免疫保護(hù)性效果的影響及其作用機(jī)制。本課題分為以下二個(gè)部分：一、
　　 CD4+CD25+Tregs在日本血吸蟲(chóng)免疫逃避中的作用及機(jī)制研究目的：通過(guò)觀察日本血吸蟲(chóng)感染對(duì)CD4+CD25+Tregs的影響及使用anti-CD25 mAb對(duì)CD4+CD25+Tregs的影響，了解CD4+CD25+Tregs在日本血吸蟲(chóng)免疫逃避中的作用及其機(jī)制。方法：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分第一部分 6～8周齡雌性BALB/c小鼠

6、隨機(jī)分成二組，即正常對(duì)照組和感染組，感染組每只小鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴40條，分別在感染后2周、3周、4周和5周剖殺小鼠，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs的比例。第二部分 6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成二組，即正常對(duì)照組和anti-CD25 mAb組，抗體組腹腔注射300 μg anti-CD25 mAb，對(duì)照組注射等體積的PBS，使用抗體后2周剖殺小鼠，無(wú)菌取脾，制備單個(gè)脾淋巴細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢

7、測(cè)各組小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs百分比。第三部分 6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成二組，即感染對(duì)照組和anti-CD25 mAb組。每只小鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴40條，感染后2周，抗體使用組每只小鼠腹腔注射300 μg anti-CD25 mAb，感染對(duì)照組注射等體積的PBS。感染后6周剖殺各組小鼠。計(jì)數(shù)蟲(chóng)荷和每克肝臟內(nèi)蟲(chóng)卵數(shù)，計(jì)算減蟲(chóng)率和每克肝臟組織中減卵率。無(wú)菌取各組小鼠脾臟，制備單個(gè)脾淋巴細(xì)胞懸液，收集脾細(xì)胞

8、培養(yǎng)上清，夾心ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞上清中細(xì)胞因子含量。結(jié)果：
　　 1）日本血吸蟲(chóng)感染后2周、3周、4周和5周，小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs百分比由感染前的1.99±0.10％分別上升至2.36±0.37％、2.8±0.05％、2.35±0.09％和2.68±0.05％。提示日本血吸蟲(chóng)感染可誘導(dǎo)機(jī)體CD4+CD25+Tregs升高。
　　 2）正常對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs百分比

9、平均值為1.99±0.10％，使用anti-CD25 mAb后2周百分比平均值為0.20±0.05％，抗體組明顯低于對(duì)照組（P<0.01）。提示anti-CD25 mAb可部分阻斷CD4+CD25+Tregs。
　　 3）使用anti-CD25 mAb組小鼠蟲(chóng)荷較未使用抗體組減少18.99％，每克肝臟蟲(chóng)卵數(shù)減少15.86％。提示CD4+CD25+Tregs下降有利于宿主對(duì)血吸蟲(chóng)的清除。
　　 4）使用anti-CD25

10、mAb組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-5明顯高于感染對(duì)照組。
　　 結(jié)論：Anti-CD25 mAb能部分阻斷CD4+CD25+Tregs，使用后有利于機(jī)體清除日本血吸蟲(chóng)。
　　 二、CD4+CD25+Tregs對(duì)日本血吸蟲(chóng)GST疫苗保護(hù)性效果的影響及其作用機(jī)制目的：通過(guò)觀察日本吸蟲(chóng)GST疫苗對(duì)CD4+CD25+Tregs的影響及anti-CD25 mAb對(duì)CD4+CD25+Tregs表達(dá)的影響，探討CD

11、4+CD25+Tregs對(duì)疫苗GST免疫保護(hù)效果的影響及其作用機(jī)制。方法：雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成五組，正常組、感染對(duì)照組、anti-CD25 mAb組、GST組以及anti-CD25 mAb與GST聯(lián)合組。GST組和聯(lián)合組小鼠背部皮下多點(diǎn)注射日本血吸蟲(chóng)GST疫苗50 μg/鼠，每次間隔2周，共免疫三次，末次免疫后2周，每只小鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴40條，感染后2周，anti-CD25 mAb組和聯(lián)合組小鼠腹腔注射anti-CD25

12、mAb 300 μg/鼠，對(duì)照組注射等體積的PBS。分別在感染后2周、3周、4周和5周剖殺四組小鼠。無(wú)菌取各組小鼠脾臟，制備單個(gè)脾淋巴細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs百分比；收集脾細(xì)胞培養(yǎng)上清，夾心ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子含量。感染后5周剖殺的小鼠同時(shí)計(jì)數(shù)蟲(chóng)荷和每克肝臟蟲(chóng)卵數(shù)，計(jì)算減蟲(chóng)率和每克肝組織中減卵率。小鼠肝組織石蠟切片HE染色，觀察各組小鼠蟲(chóng)卵肉芽腫的變化。結(jié)果：
　　 1

13、）日本血吸蟲(chóng)感染后2周，感染對(duì)照組與GST組脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs百分比平均值分別為2.36±0.37％和3.36±0.06％；感染后3周，其百分比平均值分別為2.8±0.05％和2.97±0.08％；感染后4周，其百分比平均值分別為2.35±0.09％和2.47±0.09％；感染后5周，其百分比平均值分別為2.68±0.05％和3.03±0.13％。提示GST疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體CD4+CD25+Tregs升高。
　

14、　 2）使用anti-CD25 mAb后1周（即感染后3周），感染對(duì)照組與anti-CD25 mAb組小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs百分比平均值分別為2.8±0.05％和0.13±0.04％；使用anti-CD25 mAb后2周（即感染后4周），百分比平均值分別為2.35±0.09％和0.9±0.23％；使用anti-CD25 mAb后3周（即感染后5周），百分比平均值分別為2.68±0.05％和1.93±0.03％。提

15、示使用anti-CD25 mAb后1周能部分封閉CD4+CD25+Tregs，使用anti-CD25 mAb后2周、3周其百分比逐漸上升，但仍明顯低于感染對(duì)照組。
　　 3）GST組小鼠對(duì)日本血吸蟲(chóng)減蟲(chóng)率及減卵率分別為24.98％和32％，而GST與anti-CD25 mAb聯(lián)合組減蟲(chóng)率及減卵率分別為43.43％和49％。提示anti-CD25 mAb可作為佐劑增強(qiáng)疫苗GST的保護(hù)性效果。
　　 4）日本血吸蟲(chóng)感染早期以

16、Th1型免疫反應(yīng)為主，感染后4周雌蟲(chóng)排卵后以Th2型免疫反應(yīng)為主，而使用anti-CD25 mAb后Th1型細(xì)胞因子IFN-γ仍維持在較高水平，有利于機(jī)體清除日本血吸蟲(chóng)。提示anti-CD25 mAb增強(qiáng)GST疫苗免疫保護(hù)性效果的機(jī)制為增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)Th1型免疫反應(yīng)。
　　 5）病理組織學(xué)檢查顯示各感染組單個(gè)蟲(chóng)卵肉芽腫直徑及浸潤(rùn)細(xì)胞無(wú)明顯差異。提示anti-CD25 mAb未明顯增強(qiáng)小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫的病理變化。結(jié)論：日本血吸蟲(chóng)GS

17、T疫苗能誘導(dǎo)CD4+CD25+Tregs比例上升，因而會(huì)影響疫苗的保護(hù)性效果；anti-CD25 mAb能部分阻斷CD4+CD25+Tregs，同時(shí)增強(qiáng)Th1型免疫反應(yīng)，因而能提高GST疫苗的免疫保護(hù)性效果，因此anti-CD25 mAb能作為佐劑增強(qiáng)GST疫苗的保護(hù)性效果。本研究結(jié)論如下：
　　 1）寄生蟲(chóng)的免疫逃避與CD4+CD25+Tregs有關(guān)，CD4+CD25+Tregs升高有利于血吸蟲(chóng)逃避宿主的免疫攻擊。
　　

18、 2）首次證明日本血吸蟲(chóng)GST疫苗的保護(hù)性效果與宿主的CD4+CD25+Tregs有關(guān)，GST疫苗在感染背景下能誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs升高，從而影響GST疫苗的保護(hù)性效果。
　　 3）首次證明anti-CD25 mAb可增強(qiáng)日本血吸蟲(chóng)GST疫苗的保護(hù)性效果，其作用機(jī)制是通過(guò)阻斷CD4+CD25+Tregs和增強(qiáng)Th1型免疫反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 4）首次提出 anti-CD25 mAb可作為佐劑