VGSCs在小鼠巨噬細胞系表型偏移及高脂血癥背景下循環(huán)和主動脈斑塊內單核-巨噬細胞亞群表型調節(jié)中的作用.pdf

1、研究目的:單核/巨噬細胞是機體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，作為免疫系統(tǒng)的第一道防線，維持機體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。單核/巨噬細胞是一個具有異質性的群體，根據單核/巨噬細胞表面標記物的差異表達，可分為不同的亞群，且各細胞亞群在疾病的病理過程中發(fā)揮著不同的作用。近期有研究顯示小鼠機體內單核/巨噬細胞亞群的變化會影響許多心血管疾病的病理進展，提示維持機體單核/巨噬細胞不同亞群的平衡可能是這些疾病治療的潛在靶點。苯妥英鈉(phenytoin，PHT)為

2、非選擇性電壓門控鈉通道(voltage gated sodium channels，VGSCs)阻斷劑，早期流行病學研究顯示長期服用苯妥英鈉的癲癇患者其冠心病的患病率明顯低于對照組。傳統(tǒng)觀點認為VGSCs主要存在于可興奮細胞中（神經元、心肌和骨骼?。暄芯匡@示VGSCs亦存在于巨噬細胞等非可興奮細胞中，并參與其生物表型的調節(jié)。本實驗室在近期工作中發(fā)現VGSCs在小鼠外周血單核細胞中也有表達。因此，我們提出以下假說，VGSCs參與了單

3、核/巨噬細胞亞群的表型調節(jié)，而VGSCs阻斷劑苯妥英鈉可以通過影響單核/巨噬細胞亞群的平衡，降低炎癥反應，繼而發(fā)揮心血管保護作用。
　　研究內容與方法:第一部分采用免疫磁珠分選技術純化小鼠外周血Ly6G-CD11b+單核細胞，采用real-time PCR法檢測電壓門控型鈉通道α亞單位(NaV1.1-NaV1.9和NaVX)以及β亞單位(Scnlb-Scn4b)的相對表達豐度:第二部分采用real-timePCR法檢測小鼠RAW2

4、64.7巨噬細胞系中VGSCs各亞型的表達豐度，確定與單核細胞共表達，且豐度高的VGSCs亞型;隨后采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術將特定RNAi質粒轉染至RAW264.7細胞，經Hygromycin B篩選后獲得低表達特定VGSCs亞型的穩(wěn)定細胞株。對穩(wěn)定細胞株進行如下檢測:1）Real-time PCR檢測干擾效率;2）CCK-8法測定增殖活性:3）流式細胞術檢測細胞周期和吞噬能力;4）Transwe

5、ll法檢測細胞遷移能力;5）經脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和白介素4(interleukin-4，IL-4)誘導后，real-timePCR檢測巨噬細胞表型偏移相關標志物（M1:iNOS; M2:Arg-1）的mRNA表達水平;6）流式細胞術檢測VGSCs特定亞型敲低細胞株及VGSCs阻斷劑PHT干預后細胞周期的變化。第三部分以6-8周齡雄性C57BL/6J和ApoE/-小鼠作為研究對象，隨機分為高脂飲食組和正

6、常飲食組，10周后，高脂飲食組再隨機分為PHT和生理鹽水兩個亞組，正常飲食組給予生理鹽水，繼續(xù)喂養(yǎng)4周，分別在10周和14周應用流式細胞術檢測外周血單核細胞（Ly6Chi:Ly6G-CD11b+Ly6Chi，Ly6C1o:Ly6G-CD11b+Ly6Clo）和主動脈粥樣斑塊內巨噬細胞不同亞群(Ly6ChiF4/80+:CD45+CD11b+F4/80+Ly6Chi，Ly6CloF4/80+:CD45+CD11b+F4/80+Ly6Clo

7、)的比例變化;ELISA法檢測各處理組小鼠血漿中甘油三酯和總膽固醇的水平。
　　結果:1）小鼠外周血單核細胞表達的VGSCs亞型有:NaV1.1、NaV1.3、NaV1.4、NaV1.5、NaV1.6、NaV1.7、NaV1.8、NaV1.9、NaVX、Scn1b、Scn2b、 Scn3b和Scn4b; RAW264.7細胞中表達的VGSCs亞基有:NaV1.1、NaV1.3、NaV1.4、NaV1.5、NaV1.6、NaV1.7

8、、NaV1.9和NaVX，且NaV1.4和NaV1.9的表達豐度最高。2）我們以NaV1.4為RNAi靶點，建立低表達NaV1.4的RAW264.7穩(wěn)定細胞株，real-time PCR法鑒定干擾效率約75％。低表達NaV1.4可以顯著降低RAW264.7細胞的吞噬和遷移能力，抑制LPS誘導的M1型巨噬細胞標志物iNOS表達的升高，促進IL-4誘導的M2型巨噬細胞標志物Arg1表達的升高，但對細胞的增殖活性無明顯影響。PHT可抑制RAW

9、264.7細胞的增殖活性，并隨藥物作用時間的延長抑制作用增強。3）高脂飲食可增加外周血Ly6Chi單核細胞亞群和主動脈粥樣斑塊內Ly6ChiF4/80+巨噬細胞的比例，灌胃給予小鼠PHT和生理鹽水4周后，與生理鹽水組相比，PHT組Ly6Chi單核細胞亞群和Ly6ChiF4/80+巨噬細胞亞群比例顯著降低，而Ly6Clo單核細胞亞群和Ly6CloF4/80+巨噬細胞則呈現相反的變化趨勢。4）高脂飲食增加機體總膽固醇和甘油三酯的水平，PHT