E22植酸酶的化學(xué)修飾及對其pH適性的影響研究.pdf

1、植酸及其鹽類廣泛存在于自然界的各種植物組織和糧食產(chǎn)品中，是磷和肌醇的主要存儲形式，同時對保持機(jī)體磷的平衡起重要作用。植酸酶作為一種單胃動物的飼料添加劑，可以提高植物飼料中磷的利用率，減少磷排泄對環(huán)境的污染，同時還能降低植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用。 植酸酶在動物、植物和微生物中均有發(fā)現(xiàn)。微生物植酸酶由于種類豐富、表達(dá)量相對較大、容易提取而成為商品植酸酶的重要來源。雖然國內(nèi)外己經(jīng)有數(shù)種植酸酶商品問世，但還沒有一種非常完美的產(chǎn)品。利用誘變和基因

2、工程手段改善植酸酶性質(zhì)、提高植酸酶生產(chǎn)能力是當(dāng)今植酸酶研究的主要方向。 本實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選到一株植酸酶活力較高的霉菌一黑曲霉A3214，對黑曲霉A3214進(jìn)行紫外線誘變和亞硝基孤誘變后獲得植酸酶活力提高22％的誘變株N14，利用N14的植酸酶基因構(gòu)建植酸酶基因工程醉母，獲得高植酸酶活力的植酸酶基因工程酵母E22。 本研究對酵母工程菌E22所產(chǎn)的植酸酶進(jìn)行分離純化，得到電泳純的酶液。使用不同的化學(xué)修飾劑對純酶液進(jìn)行化學(xué)修

3、飾研究不同基團(tuán)對酶的影響特別是對酶液pH適性的影響。主要研究與結(jié)果如下。 1.植酸酶的分離純化 利用BMGY、BMMY兩種畢赤酵母培養(yǎng)基對E22酵母工程菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，過濾離心后獲得相應(yīng)植酸酶粗酶液。粗酶液通過66％的丙酮沉淀分離、透析過夜，最后上sepharose fast flow 離子交換層析柱，用500mL0.01MpH5.0醋酸緩沖液洗雜，再用400mL 1mol/L氯化鈉加上400mL蒸餾水梯度淋洗，分部

4、收集酶液，獲得電泳純的E22植酸酶液。 2.植酸酶的化學(xué)修飾 用不同濃度的IAc、巰基乙醇、TNBS、NBS、PMSF、Phenylglyoxal等六種化學(xué)修飾劑與植酸酶純酶液作川，然后在正常條件下測定植酸酶的活性，以不用修飾劑時的植酸酶活性為100％，分析修飾劑對植酸酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)表明：完全修飾后，IAc、疏基乙醇、Phenylglyoxa1修飾的植酸酶酶活完全消失，而TNBS、NBS、PMSF所修飾的植酸酶隨著修

5、飾劑濃度的增大，酶活性逐漸降低，當(dāng)修飾劑濃度分別達(dá)到5mmol/L、11mmol/L、6mmol/L時活力則保持穩(wěn)定不再下降。 3.化學(xué)修飾對植酸酶pH適性的影響 用5mmol/L TNBS、13mmol/L NBS、9mmol/L PMSF分別修飾植酸酶酶液，在不同的pH條件下測定其活性變化情況，與未修飾酶作出分析比較，研究修飾基團(tuán)對植酸酶pH適性的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用TNBS修飾植酸酶的賴氨酸殘基，酶活分

6、別在pH2.5和pH5都有一個最適點(diǎn)，與未被修飾的植酸酶比較，修飾后的植酸酶的最適pH發(fā)生了小小的平移，并且相對于原始植酸酶pH的適性擴(kuò)展到了pH9，在pH8.0時候修飾酶的活力仍有90u/ml左右；NBS修飾酶的色氨酸殘基后，其活性在pH2.5處的一個最適點(diǎn)基本消失，而在pH5.5和JpH6.0則有一個酶活最高峰；PMSF修飾酶的絲氨酸殘基后，第一個酶活高峰出現(xiàn)在pH3，第二個高峰與未被修飾的植酸酶一樣出現(xiàn)在pH5.5，考慮到實(shí)驗(yàn)誤差