營養(yǎng)期殺蟲蛋白對林業(yè)害蟲的活性測定和植物表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bt)是世界上應(yīng)用面積最廣、研究最為深入、應(yīng)用最成功殺蟲微生物。營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vips)是一類BT在營養(yǎng)期分泌的新型殺蟲蛋白。本論文分析了營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3A對鱗翅目林木害蟲的生物活性，構(gòu)建了vip3A(a)基因植物表達(dá)載體，對植物轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行了研究。 1.Bt營養(yǎng)期殺蟲蛋白對鱗翅目林木害蟲生物活性研究Bt產(chǎn)生的伴孢晶體蛋白(ICPs)對多種農(nóng)林重要害蟲有很高的生物活性，營養(yǎng)期殺蟲蛋白是一類與BT伴孢晶體蛋

2、白殺蟲機理不同的新型蛋白，vip3A蛋白對多種重要農(nóng)業(yè)害蟲有活性，而該類蛋白對林木重要害蟲美國白蛾和楊扇舟蛾的生物活性研究尚未見報道。 本實驗利用本實驗室克隆的蘇云金芽孢桿菌Vip3A-LS1和Vip3A-LS8基因，構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pPV113和pPV116，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析均檢測出約88kD的Vip3A蛋白。生物學(xué)活性檢測結(jié)果表明，重組蛋白對初孵美國白蛾幼蟲和楊扇舟蛾

3、初孵幼蟲均有較高的殺蟲活性，當(dāng)用80μg/g(蛋白/飼料)的vip3A-LS1蛋白處理初孵美國白蛾幼蟲時，平均校正死亡率達(dá)到(53.02±0.43)％，體重抑制率達(dá)到了80.60％，對楊扇舟蛾初孵幼蟲平均校正死亡率達(dá)到(68.00±0.60)％；同濃度的Vip3A-LS8蛋白對初孵美國白蛾平均校正死亡率達(dá)(52.12±0.53)％，體重抑制率高達(dá)78.90％，對楊扇舟蛾初孵幼蟲平均校正死亡率達(dá)到(70.0±0.53)％，首次發(fā)現(xiàn)Vip3

4、A蛋白對林木重要害蟲有較高殺蟲活性。 2.Vip3A(a)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建和植物轉(zhuǎn)化研究生物農(nóng)藥雖然對環(huán)境的負(fù)面影響較少，但也存在防治效果較差、不穩(wěn)定等缺陷。隨著植物基因工程研究的深入，通過基因工程改造獲得抗蟲植物已經(jīng)成為生物防治熱點，其中Bt基因在林木特別是楊樹的轉(zhuǎn)化已有成功報道。為克服靶試?yán)ハx對單-基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生抗性，多基因或者不同抗蟲機制基因的轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為相關(guān)研究的熱點。本研究擬將Vip3A(a)基因通過農(nóng)桿菌介

5、導(dǎo)方式轉(zhuǎn)化含有CrylA和ApIA雙抗蟲基因的轉(zhuǎn)基因楊樹，研究轉(zhuǎn)化子的抗蟲性，以及轉(zhuǎn)化子在基因和表達(dá)產(chǎn)物水平的協(xié)同效應(yīng)。 以重組質(zhì)粒pPV113和pPV116為模板，根據(jù)已發(fā)表的Vip3A(a)基因序列，參照文獻(xiàn)設(shè)計的引物擴增出一條大約2.37kb目的片斷，將其目的片斷插入植物表達(dá)載體pB1121，把pB1121上的表達(dá)框架插入pCAU1302的多克隆位點，構(gòu)建了p1302PI113和p1302PI116兩個表達(dá)載體。