香煙煙霧經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡促進(jìn)慢性阻塞性肺疾病發(fā)生發(fā)展.pdf

1、【目的】初步研究香煙煙霧是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡促進(jìn)慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發(fā)生發(fā)展;
　　【方法】研究分為動物實驗和臨床實驗兩部分。
　　1.動物實驗部分:40只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、吸煙2個月組、吸煙4個月組和戒煙組(吸煙4個月然后戒煙1個月),采用單純被動吸煙法復(fù)制COPD模型,在各組相應(yīng)的時間點通過測定肺通氣功能和觀察肺組織病理學(xué)變化對大鼠COPD模型進(jìn)行評價。收集對照組和實驗組大鼠肺

2、組織標(biāo)本,采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況,原位雜交和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測CHOPmRNA表達(dá)水平,并采用免疫組織化學(xué)、免疫印跡方法檢測PERK、P-PERK、CHOP蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　2.臨床實驗部分:通過肺癌肺葉切除手術(shù)收集不吸煙非COPD、吸煙非COPD、吸煙COPD患者肺組織標(biāo)本各10例;采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況,原位雜交檢測CHOPmRNA表達(dá)水平,并采用免疫組織化學(xué)檢測PERK、P-

3、PERK、CHOP蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　【結(jié)果】
　　Ⅰ.動物試驗部分結(jié)果
　　(1)吸煙2個月組大鼠0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)和呼氣峰流速(PEF)顯著低于對照組(FEV0.375.48±2.57(％) VS83.47±4.98(%),PEF33.42±3.21 VS40.11±3.66(ml/s) P均<0.05);吸煙4個月組大鼠肺通氣功能較吸煙2個月組進(jìn)一步降低(FEV0.366.18±4.12(%)

4、 VS75.48±2.57(%),PEF25.89±2.22(ml/s)VS33.42±3.21(ml/s),P均<0.05);戒煙組與吸煙4個月組大鼠肺通氣功能無顯著性差異(P均>0.05)。
　　(2)肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果:與對照組相比,吸煙兩個月組大鼠肺結(jié)構(gòu)紊亂,部分肺泡出現(xiàn)破裂;吸煙四個月組大鼠肺結(jié)構(gòu)紊亂更明顯,肺泡壁破裂,肺泡腔擴大,部分融合成肺大泡;戒煙組大鼠肺泡腔擴大較吸煙四個月組無顯著改變
　　(3) TUN

5、EL結(jié)果顯示:凋亡細(xì)胞主要是肺泡上皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。對照組大鼠肺組織的凋亡率為11.442±1.724(%),在吸煙兩個月大鼠較對照組明顯升高(22.400±1.615(%) VS11.442±1.724(%),P<0.05),在吸煙四個月大鼠中則進(jìn)一步明顯升高(34.830±3.201(%) VS22.400±1.615(%), P<0.05),在戒煙組大鼠稍微下降(P>0.05)。
　　(4)原位雜交結(jié)果顯

6、示CHOP主要定位于肺泡上皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞,支氣管上皮細(xì)胞中,RT-PCR檢測結(jié)果示吸煙兩個月大鼠CHOP較對照組明顯升高(P<0.05),吸煙四個月大鼠較兩個月大鼠比較則進(jìn)一步顯著升高(P<0.05),而戒煙組大鼠與吸煙四個月大鼠相比較則沒有很大區(qū)別(P>0.05)。
　　(5)免疫組化結(jié)果顯示PERK主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞,支氣管上皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿,在對照組大鼠和吸煙組大鼠沒有顯著差別;P-PERK主要定位于肺泡

7、上皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞,支氣管上皮細(xì)胞的胞漿,在對照組大鼠表達(dá)最低,吸煙兩個月大鼠表達(dá)較對照組顯著升高(P<0.05),吸煙四個月表達(dá)較吸煙兩個月大鼠明顯升高(P<0.05),而戒煙組大鼠較吸煙四個月組大鼠相比較則沒有顯著差別(P>0.05);而CHOP主要定位于肺泡上皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞,支氣管上皮細(xì)胞的胞核中;吸煙兩個月大鼠CHOP較對照組明顯升高(P<0.05),吸煙四個月大鼠較兩個月大鼠比較則進(jìn)一步明顯升高(P<0.05),而戒

8、煙組大鼠與吸煙四個月大鼠相比較則沒有明顯差別(P>0.05);Western blot檢測結(jié)果和免疫組化一致。
　　(6)相關(guān)分析顯示細(xì)胞凋亡率、CHOPmRNA、CHOP蛋白以及P-PERK蛋白表達(dá)與肺功能呈負(fù)相關(guān),細(xì)胞凋亡率與CHOPmRNA和蛋白呈正相關(guān), CHOPmRNA表達(dá)與CHOP蛋白表達(dá)呈正相關(guān),P-PERK蛋白表達(dá)與CHOP表達(dá)呈正相關(guān)。
　　Ⅱ臨床試驗部分結(jié)果
　　(1)對照組第一秒用力呼氣容積與用力

9、肺活量的比值(FEV1.0/FVC(%))和FEV1占預(yù)計值百分比(FEV1(%))顯著高于吸煙組(FEV1.0/FVC(%)88±6.82(%) VS79.46±6.62(%),FEV1(%)89.31±6.06(%) VS81.4±6.83(%) P均<0.05);吸煙組肺通氣功能較 COPD組進(jìn)一步降低(FEV1.0/FVC(%)79.46±6.62(%) VS58.54±6.23(%),FEV1(%)81.4±6.83(%) V

10、S63.50±7.20(%) P均<0.05)。
　　(2)肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果:與對照組比,COPD組上皮層、平滑肌層增厚,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,上皮細(xì)胞部分脫落,管壁大量炎癥細(xì)胞浸潤,肺泡管、肺泡囊及肺泡擴大,肺泡壁斷裂,可見部分肺泡融合成肺大泡。非COPD吸煙者肺組織結(jié)構(gòu)與對照組無明顯差異。
　　(3) TUNEL結(jié)果顯示:凋亡細(xì)胞主要是肺泡上皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。對照組人群肺組織的凋亡率最低12.5±2.8(

11、%),在吸煙非COPD組人群較對照組明顯升高(18.4±2.4(%) VS12.5±2.8(%),P<0.05),在吸煙COPD組人群中則進(jìn)一步明顯升高(34.6±3.0(%) VS18.4±2.4(%),P<0.05),
　　(4)原位雜交結(jié)果顯示CHOP主要定位于肺泡上皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞,支氣管上皮細(xì)胞中,檢測結(jié)果示吸煙非COPD較對照組明顯升高(P<0.05),吸煙COPD組較吸煙非COPD組比較則進(jìn)一步顯著升高(P<0.

12、05)。
　　(5)免疫組化結(jié)果顯示PERK主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞,支氣管上皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿,在非吸煙組人群和吸煙組人群沒有顯著差別;P-PERK主要定位于肺泡上皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞,支氣管上皮細(xì)胞的胞漿;在對照組表達(dá)最低,吸煙非COPD組人群表達(dá)較對照組顯著升高(P<0.05),吸煙COPD組人群表達(dá)較吸煙非COPD組人群明顯升高(P<0.05);而CHOP蛋白主要定位于肺泡上皮細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞,支氣管上皮細(xì)胞的胞核

13、中;吸煙非COPD組人群CHOP較對照組明顯升高(P<0.05),吸煙COPD組人群較吸煙非COPD組人群比較則進(jìn)一步明顯升高(P<0.05)。
　　(6)相關(guān)分析顯示細(xì)胞凋亡率、CHOPmRNA、CHOP蛋白以及P-PERK蛋白表達(dá)與肺功能呈負(fù)相關(guān),細(xì)胞凋亡率與CHOPmRNA和蛋白呈正相關(guān), CHOPmRNA表達(dá)與CHOP蛋白表達(dá)呈正相關(guān),P-PERK蛋白表達(dá)與CHOP表達(dá)呈正相關(guān)。
　　【結(jié)論】
　　1.PERK