NDV HN蛋白潛在抗原表位的分段表達(dá)及免疫學(xué)活性分析.pdf

1、本研究以新城疫病毒F48E9株和LaSota株HN結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列為依據(jù),先采用Chou-Fasman方法、Garnier-Robson方法、Emini方法、Kyte-Doolittle方法和Karplus-Schulz方法分別預(yù)測(cè)HN蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面可能性、親水性和柔韌性,單參數(shù)分析HN蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；再通過(guò)Jameson-Wolf方法,綜合不同的參數(shù)評(píng)價(jià)HN蛋白各個(gè)部位的抗原性。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,新城疫病毒F48E9株與LaS

2、ota株HN結(jié)構(gòu)蛋白間共有13個(gè)潛在抗原表位存在差異,其中第10個(gè)(212-218AA)和第21個(gè)(492-498AA)表位的氨基酸序列從峰值上看差異極顯著,很可能是新城疫病毒的保護(hù)性抗原表位。本研究為進(jìn)一步通過(guò)試驗(yàn)方法確定新城疫病毒HN結(jié)構(gòu)蛋白的保護(hù)性抗原表位,研制有效的新城疫疫苗,提供一定的理論依據(jù)。 預(yù)測(cè)分析HN結(jié)構(gòu)蛋白是構(gòu)成NDV囊膜表面纖突的主要成分,可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,是NDV的主要保護(hù)性抗原之一。為確定HN蛋白

3、保護(hù)性抗原表位的位置,本研究進(jìn)行了HN基因的分段克隆、原核表達(dá)以及HN分段重組蛋白的免疫反應(yīng)性分析。 首先,根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的NDV F48E9株HN基因序列及pGEX-4T-1載體多克隆位點(diǎn)序列,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,從接種NDV的雞胚尿囊液中擴(kuò)增出NDV F48E9株HN全基因。再以HN全基因重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HNq為模板,根據(jù)先前預(yù)測(cè)的F48E9株與LaSota株HN結(jié)構(gòu)蛋白潛在抗原表位的差異,分別設(shè)計(jì)四

4、對(duì)引物,將HN基因分成連續(xù)的4個(gè)片段,構(gòu)建分段表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-P225、pGEX-4T-1-P435、pGEX-4T-1-P444和pGEX-4T-1-P558。PCR鑒定和序列測(cè)定結(jié)果表明,分段表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 其次,誘導(dǎo)原核表達(dá)HN基因分段重組蛋白GST-HN225、GST-HN435、GST-HN444和GST-HN558,鑒定表達(dá)形式、優(yōu)化表達(dá)條件后,進(jìn)行大量表達(dá)。用反復(fù)凍融和超聲方法裂解表達(dá)菌,提

5、取融合蛋白,再對(duì)其進(jìn)行透析復(fù)性、親和層析純化。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明,所克隆的4個(gè)基因片段在大腸桿菌中得到表達(dá),獲得分子量約為33.5KD、40.5KD、40.8KD、44.6KD的融合蛋白,與預(yù)期結(jié)果相符,并且0.75mmol/LIPTG誘導(dǎo)3h表達(dá)效果最好,表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。 最后,用純化的HN基因分段重組蛋白GST-HN225、GST-HN435、GST-HN444和GST-HN558免疫小鼠,制備相應(yīng)的