水貂和貉Toll樣受體基因的克隆及表達分析和貉外周血單個核細胞轉錄組學研究.pdf

1、近年來，隨著毛皮動物飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展、飼養(yǎng)管理不當和抗病力下降等原因，致使毛皮動物疫病在有些地區(qū)爆發(fā)，導致毛皮動物大規(guī)模的死亡。因此，深入了解并研究毛皮動物免疫防御機制，尋找提高機體抗病能力的有效方法，同時培育抗病品系，是毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的必驅之勢。
　　本研究以雪貂TLRs基因為參考序列設計四對引物，從水貂PBMCs中擴增TLR4、TLR6、TLR7及TLR8部分基因，分別進行分子克隆并對所得序列進行生物信息學分析，進一步利用

2、半定量RT-PCR技術分析TLR4和TLR7基因mRNA在不同年齡水貂的各組織（肝臟、肺臟、肌肉、腎臟、小腸、脾臟）及PBMCs中的表達情況。結果表明，水貂TLRs與食肉目動物（雪貂、北極熊、大熊貓、海象、海豹、犬、老虎、貓）具有較高的同源性，在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離最近;與禽類、魚同源性較低;TLR7基因在不同物種間具有較高的保守性，而TLR4基因的保守性最低。組織表達分析表明，TLR4和TLR7在檢測的組織中廣泛表達且表達量存在差異，相比

3、成年水貂，仔貂各組織中TLR4和TLR7基因表達量更高。
　　本研究系國內首次利用RT-PCR和RACE技術，以犬TLR8基因為參考序列設計引物，克隆了貉TLR8基因全長序列，應用生物信息學軟件分析該基因及預期編碼蛋白的特征。結果顯示該基因全長3199bp，ORF全長3114bp，編碼1038個氨基酸，含有Toll樣受體家族典型的結構域特征。同源性分析顯示貉TLR8基因核苷酸序列與犬同源性最高，達99.3％;與其他食肉目哺乳動物也

4、有較高的同源性，在89.2％-92.9％之間:與魚類同源性最低，親緣關系最遠。
　　采用二代測序技術，對貉PBMCs轉錄組進行了RNA-Seq測序、de novo拼接和信息比對研究。結果表明:轉錄組測序共得到了3.1GB的原始數(shù)據(jù)，共32245804個讀長，去除載體信息的數(shù)據(jù)量為28797350個讀長。經(jīng)質量控制和de novo拼接后，對組裝出來的轉錄本利用TransDecoder鑒定coding區(qū)域，共獲得了118868條貉轉錄

5、本，其平均長度為525.53bp。利用Trinotate對ORF和contigs進行功能注釋，用Uniprot database、RNAMMER、eggNOG、GO、KEGG對預測出來的序列進行注釋，其中，COG功能注釋中信號轉導機制(T)及防御機理(V)，KEGG注釋通路中B/T-細胞受體信號通路、TLR/NLR/ RIR受體信號通路、吞噬體通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性通路均與貉免疫應答與抗病相關。
　　通過對水貂TLR4、