草魚3個Toll樣受體基因克隆和表達及與細菌性敗血癥關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、草魚是我國重要的養(yǎng)殖魚類，但是病害頻發(fā)給草魚養(yǎng)殖帶來很大的經(jīng)濟損失。研究草魚免疫基因，培育抗病力強的草魚新品種是一條有效的途徑。Toll樣受體（TLRs）是固有性免疫系統(tǒng)中的細胞跨膜受體及病原模式識別受體之一，它主要通過識別病原相關(guān)分子模式（PAMPs）來啟動免疫反應(yīng)。本研究克隆獲得草魚受體TLR21、TLR20和TR18基因，分析其序列，并采用草魚呼腸孤病毒和嗜水氣單胞菌對草魚進行誘導(dǎo)，研究這些基因在草魚不同組織及其受病毒（GCRV）

2、和細菌誘導(dǎo)感染后的表達情況，進行不同基因型與草魚細菌性敗血癥的關(guān)聯(lián)分析，取得了如下結(jié)果：
　　1.根據(jù)斑馬魚的TLR21基因cDNA保守序列設(shè)計引物，通過同源克隆技術(shù)獲得草魚TLR21基因的部分cDNA片段，采用RACE技術(shù)獲得草魚TLR21基因的cDNA全長序列3578bp，其中開放閱讀框（ORF）2958 bp，編碼985個氨基酸，含有24個氨基酸的信號肽。經(jīng)SMART軟件分析，該受體包含17個富亮氨酸區(qū)（LRRs）、一個跨膜

3、區(qū)和一個TIR保守區(qū)。Blast分析發(fā)現(xiàn)，草魚TLR21氨基酸序列與斑馬魚的相似度最高，達到79％。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：草魚TLR21基因在所檢測的12個組織中均有表達，其中以皮膚、脾臟和腸組織表達量最高，在肌肉、中腎和心臟組織表達量較低；經(jīng)GCRV誘導(dǎo)后，草魚TLR21基因在肝臟和脾臟組織的表達量顯著下調(diào)，而經(jīng)嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)后該基因在肝臟和脾臟組織的表達量顯著上調(diào)。
　　2.根據(jù)斑馬魚的TLR20基因cDNA保守序列設(shè)

4、計引物，通過同源克隆技術(shù)獲得草魚TLR20基因的部分cDNA片段，采用RACE技術(shù)獲得草魚TLR20基因的cDNA全長序列3197 bp，其中ORF長2835 bp，編碼944個氨基酸，含有19個氨基酸的信號肽。經(jīng)SMART軟件分析，該受體包含6個LRRs、一個跨膜區(qū)和一個TIR保守區(qū)。Blast分析發(fā)現(xiàn)，草魚TLR20氨基酸序列與鯉魚的相似度最高，達到78%。熒光定量PCR結(jié)果顯示，該基因在所檢測的10個組織中均有表達，其中以脾臟、頭

5、腎和肝臟組織表達水平較高，在中腎和心臟組織表達量較低；經(jīng) GCRV誘導(dǎo)后，TLR20基因在肝臟組織顯著下調(diào)，在脾臟組織4h顯著下調(diào)然后表現(xiàn)出高表達的水平，在鰓和腎臟組織表達水平均較高；TLR20基因經(jīng)嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)后在肝臟組織4h表達水平迅速上調(diào)然后迅速下調(diào)，在脾臟組織3天內(nèi)逐漸上升然后在第7天受到顯著抑制，在鰓和腎臟組織表達水平較高。
　　3.從本實驗室轉(zhuǎn)錄組序列獲得草魚TLR18基因的部分cDNA片段，采用RACE技術(shù)獲得該

6、基因cDNA全長序列3600 bp，其中ORF長2559 bp，共編碼852個氨基酸，含有22個氨基酸信號肽。經(jīng)SMART軟件分析，該受體包含7個LRRs、一個跨膜區(qū)和一個TIR保守區(qū)。草魚與斑馬魚的TLR18氨基酸序列相似度最高，高達85%。熒光定量PCR結(jié)果顯示，該基因在所檢測的9個組織中均有表達，其中以脾臟、鰓和心臟組織表達量較高，在肝臟、皮膚和腦組織表達量較低。經(jīng)GCRV誘導(dǎo)后，TLR18基因在肝臟組織4h顯著上調(diào)然后受到顯著抑

7、制，在脾臟組織3天表達水平顯著上調(diào)然后第7天表達水平顯著下調(diào)；經(jīng)嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)后，該基因在肝臟組織表達水平受到抑制，在脾臟組織4h和第7天受到顯著抑制。
　　4.草魚TLR21基因的多態(tài)性與細菌性敗血癥的關(guān)聯(lián)分析。采用人工感染嗜水氣單胞菌的方法，建立了草魚易感群體（132尾）和抗病群體（143尾），通過直接測序法篩選SNPs位點。在TLR21基因中共獲得了6個SNP位點，并研究這些多態(tài)性位點與抗逆性狀的相關(guān)性。其中，1470T-